荷叶碱降尿酸的1H-NMR代谢组学研究*

高利兴，王丽明，隋洪飞，韩立峰

（1．天津中医药大学第二附属医院，天津 300250；2．天津中医药大学，组分中药国家重点实验室，天津 301617）

近年来，随着社会经济的发展，人们生活方式和饮食结构发生了很大改变，高尿酸血症作为一种代谢性疾病，其发病率持续升高，严重危害患者身体健康。高尿酸血症是一种嘌呤代谢异常引起的疾病，是导致痛风发病的主要诱导因素和直接病因，高尿酸血症还可诱发中风、糖尿病、冠心病和脑血管病、冠状动脉疾病、肾脏损伤等严重性疾病[1-3]。高尿酸血症的特点是在正常嘌呤饮食状态下，非同日两次测空腹血尿酸水平男性为血清尿酸盐大于70 mg/L，女性为大于60 mg/L[4]。高尿酸血症的危害除了引发痛风外[5-6]，还可加重冠心病或高血压病等病症[7-8]。此外，长期高尿酸血症可破坏胰腺β细胞功能而诱发糖尿病[9]。大量尿酸长期从肾小管通过，形成尿酸结晶、结石沉积于肾脏，还会引发痛风性肾病，肾功能损害，甚至尿毒症[10-12]。

荷叶碱是荷叶中主要的阿朴啡型生物碱，为荷叶生物碱中主要活性成分[13-14]。近年来，荷叶碱的药理作用日益显著，有文献报道在小鼠高尿酸血症模型中，荷叶碱的抗高尿酸和抗炎作用是通过调节肾有机离子转运体和炎症信号通路发挥作用，但是荷叶碱对生命体整体代谢网络的影响仍有待进一步研究[15]。

代谢组学是一种被广泛应用于植物学、疾病诊断和毒理学等领域的系统研究方法[16-19]。代谢组学研究常用的样本有尿液、血浆或血清、唾液、脑脊液等生物体液及细胞提取物、细胞培养液和组织等，针对这些样本的代谢产物研究可以反映机体健康状态或疾病状态下的重要信息。目前，代谢组学技术分析方法有许多，应用最广泛的是气相色谱-质谱联用法（GC-MS）、液相色谱-质谱联用法（LC-MS）及核磁共振法（NMR）[20]。NMR作为代谢组学的一个重要研究手段，具有分析全面、样品制备简单、重现性好的特点，而且可以同时提供代谢物定性、定量两方面的信息[21]。

本研究主要运用核磁共振氢谱（1H-NMR）技术，将荷叶碱对氧嗪酸钾诱导的高尿酸小鼠的血浆和尿液进行非靶向代谢组学研究，较为系统地分析氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症模型小鼠及荷叶碱治疗后的代谢物水平变化，通过多元统计分析找出变化显著的代谢物，揭示氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症模型动物的潜在生物标志物，同时为探讨荷叶碱治疗高尿酸血症的作用机制提供参考。

1 实验材料

1.1 实验仪器 Bruker ASCEND 500 MHz超导傅里叶变换核磁共振谱仪（瑞士Bruker公司）；3K15型高速离心机（美国Sigma公司）；XW-80A型涡旋混合器（上海沪西分析仪器厂）；HSS型电热恒温水浴锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；电热真空干燥箱（天津市天宇实验仪器有限公司）；KQ-250E超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 实验试剂 重水（D2O，99．9%D）用于锁场（剑桥同位素实验室，美国）；2，2，3，3，-d4-3（三甲基硅基）丙酸钠盐（TSP），阿法埃莎化学有限公司]用于化学位移定标及定量分析；超纯水（优级，屈臣氏公司）；磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O，天津市光复科技发展有限公司）；磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O，天津市风船化学试剂科技有限公司）；羧甲基纤维素钠（CMC-Na，天津市光复科技发展有限公司，用于溶解灌胃样品）。

1.3 实验药材 荷叶碱标准品购自成都瑞芬思生物科技有限公司，纯度大于98%；氧嗪酸钾购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司，纯度大于98%。

1.4 实验动物 昆明雄性小鼠24只，体质量为（20±2）g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。小鼠在实验动物室进行为期1周的环境适应饲养，它们允许自由饮食及饮水，实验动物房条件为：温度：22～24℃，湿度：50%～65%的湿度，12 h光/暗周期。给药前12 h禁食不禁水。所有动物实验程序严格按照中国实验动物学会标准进行，并经天津中医药大学医学伦理委员会批准（小鼠合格证号：11400700389190）。

将荷叶碱和氧嗪酸钾分别溶解在0．5%的羧甲基纤维素钠混悬液中，根据前期研究，荷叶碱与氧嗪酸钾的给药剂量分别为25 mg/kg和200 mg/kg。

将小鼠按照每组8只随机分为空白组、模型组和荷叶碱组。在本实验中，空白组给予0．5%的羧甲基纤维素钠灌胃；荷叶碱组先给予氧酸钾灌胃，1 h后给予荷叶碱灌胃；模型组给予氧嗪酸钾灌胃；均连续灌胃14 d。对于尿液样品按照上述方法给药后第13天将3组小鼠分别放入代谢笼过夜24 h，收集尿液，14 000 r/min，离心10 min，离心半径10 cm，取上清液分装存放-80℃冰箱，冷冻待用；血浆样品在收集完尿样后按照上述方法给药后分别于2 h后眼眶静脉丛取血，7 000 r/min离心10 min，离心半径10 cm，取上清液，置于-80℃待测。

2 实验方法

2.1 核磁实验方法

2.1.1 缓冲溶液的配制 0．045mol/LK2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液的配制：按照K2HPO4∶NaH2PO4的质量比为4∶1，加 10%D2O 和 0．6 mmol/L TSP 溶液溶解，用 pH计调节pH=7．4用于血浆样品检测。

2.1.2 1．5 mol/L K2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液的配制K2HPO4∶NaH2PO4=4∶1，加入 10%的 D2O 及 0．01%的TSP溶解，用pH计调节pH=7．4，用于尿样检测。

2.1.3 待测样品的配制 将尿液放在室温下自然解冻，14 000 r/min离心10 min，离心半径10 cm，取上清液，550 μL 尿液加入 55 μL 1．5 mol/L K2HPO4-NaH2PO4的缓冲溶液，涡旋5 min，14 000 r/min离心5 min，离心半径10 cm，取上清液550 μL至5 mm核磁管中分析。将血浆样品放在室温下自然解冻，涡旋 5 min，取 200 μL 血浆加入 400 μL 的 0．045 mol/L K2HPO4-NaH2PO4的缓冲溶液，涡旋 5min，14000r/min离心5min，取上清液550μL至5mm核磁管中分析。

2.1.4 NMR实验参数 Bruker ASCEND 500 MHz采集1H-NMR谱，反相检测探头（BBI），采集温度为298 K，noesypr1d脉冲序列。此序列采用预饱和方式压制溶剂峰，从而抑制溶剂信号的检测。循环时间（D1），混合时间（D8）以及 90°脉冲时间（P1）分别为 2s，0．2 s，12．91 μs，中心激发频率（O1P）为 4．69 ppm，预饱和水峰压制功率（PLW9）为23 dB。采样点数为32k，谱宽（SW）为10，330Hz，扫描次数（NS）为160次。

2D NMR谱图均采用标准脉冲序列，其中包括COSY（1H-1H相关），HSQC，（1H-13C直接相关）HMBC（1H-13C远程相关），TOCSY（1H-1H 全相关），J-RES（J-分辨光谱）。COSY脉冲序列为cosygpmfqf，梯度恢复时间（D16）为 0．2 μs，F1（1H）和 F2（1H）谱宽均为4 464．286 Hz，采样点数阵为 t2×t1=2048×128，NS 为128次，2k数据点。HSQC的脉冲序列为hsqcetgpsi，其F1（13C）和 F2（1H）SW为 20831．980Hz和 4464．286Hz，弛豫时间为 1．457 811 s，采集时间为 0．118 834 s，采集数据点阵 t2×t1=1 024×256，NS 为 80 次，1 k 数据点。HMBC 的脉冲序列为 hmbcgpndqf，其 F1（13C）和F2（1H）SW 为 27 932．973 Hz 和 4 464．286 Hz，弛豫时间为 1．332 064 03 s，采集时间为 0．475 186 s，预扫描延迟时间为 6．50 μs，采集数据点阵 t2×t1=4 096×256，NS为160次，4k数据点。TOCSY脉冲序列为mlevphpp，其 F1（13C）和 F2（1H）SW 均为 4464．286Hz，弛豫时间为 1．898 965 s，采集时间为 0．237 618 s，D8为 0．08s，采集数据点阵 t2×t1=2048×256，NS为 100 次。J-RES的脉冲序列为jresqf，弛豫时间为2 s，采集时间为 0．102 450 s，F1 和 F2 维 SW 分别为 20．000 Hz和10 000．000 Hz，采样数据点阵为 t2×t1=2 048×256，NS为32次，2 k数据点。

2.1.5 方法学考察 本实验主要以样品某一特征峰对应的化学位移以及相对峰面积考察样品的稳定性及仪器的精密度。

稳定性实验：任意选取一个样品放置2、4、8、10、12、18、24及36 h后检测特征峰的化学位移和相对峰面积，分别计算RSD（相对标准偏差）值。

精密度实验：同一个样品连续采集6次1HNMR谱图，计算特征峰的化学位移和相对峰面积RSD值。

2.1.6 数据处理与分析1D NMR及2D NMR图谱预处理使用Topspin（V3．5）软件，包括指数窗函数变换、相位校正及基线矫正、化学位移漂移矫正（使用TSP）。多元统计分析用1H-NMR数据处理采用MestReNova 9．0．1 软件，线宽因子设为 0．3 Hz，自由感应衰变为零填充到64 k数据点。除去TSP δ 0．00～0．02 ppm，水峰 δ 4．65～4．85 ppm。核磁共振光谱区以0．003 ppm 积分段对化学位移区间 δ 0．45～12．50 ppm进行分段积分。积分所得数据进行归一化，并转换为二维矩阵，保存为 CSV 格式，使用 SIMCA-P+（v14．0）软件进行多变量分析，主要通过PCA（主成分分析）和OPLS-DA（正交偏最小二乘法判别分析）模型进行分析。PCA模型主要看样本间分组趋势以及样本组内的离散程度；OPLS-DA模型主要得到得分散点图和pearson图。在得分散点图中，每一个点代表不同的样本，以样本类别为变量（Y）建立一个PLS（最小二乘）模型，并获得几个与Y不相关的自变量（X）信息并将其替换，从而提高了模型识别能力。其中主要包括R2X，Q2两个质量评价指标，越接近于1，代表预测的结果真实，模型可靠。在pearson图中，核磁共振光谱区颜色越红代表化合物差异越显著，从而揭示了不同实验方法中的代谢物的显著变化。将OPLS-DA模型所给出的每一个变量的VIP值中大于1的变量作为对模型分组贡献最大，并将此数据导出，结合 t检验，筛选 VIP＞1 且 P＜0．05 的变量进行分析。

将上述所得到的潜在差异代谢物的信息，通过2D NMR谱图，数据库（Human Metabolome Database，https：//hmdb．ca/）检索，以及 Chenomx NMR Suite 软件数据库（Chenomx Inc．）等方法进行结构鉴定。

3 实验结果

3.1 血浆尿酸检测结果 将收集的血浆样品室温下自然解冻，涡旋5 min，混旋均匀，血浆中的尿酸水平用尿酸试剂盒进行检测，所有血浆样本均放于96孔板进行检测，血浆尿酸的处理方法按照试剂盒使用说明书所描述的方法在自动生化分析仪（TECAN，瑞士）中测量，2h后结果空白组是（132．70±4．30）μmol/L、模型组是（188．14±4．81）μmol/L、荷叶碱组是（130．46±4．70）μmol/L，模型组与空白组相比（P＜0．01），荷叶碱组与模型组相比（P＜0．01），差异均具有统计学意义。

3.2 核磁实验结果

3.2.1 方法学考察 样品稳定性实验特征峰的化学位移RSD值及相对峰面积RSD值如表1所示，结果表明样品36 h内稳定。精密度实验血样和尿样的特征峰的化学位移RSD值和相对峰面积RSD值均小于5%，说明仪器测量精密度良好。

表1 基于1H-NMR样品中特征峰的精密度及稳定性Tab.1 The precision and stability of characteristic peaks in1H-NMR samples %

3.2.2 基于1H-NMR荷叶碱血浆和尿液样品的指纹图谱 荷叶碱作用于氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症小鼠的血浆和尿液的核磁共振图谱如图1和2所示。其中 δ 0．05～4．00 ppm 为氨基酸及有机酸区，δ 4．00～5．50 ppm 为碳水化合物区，δ 5．50～8．70 ppm为芳香区。代谢产物的鉴定主要是基于文献，在线数据库（HMDB）以及Chenomx软件，并结合2D NMR图谱进行分析，共筛选出50个化合物。

图1 空白组、模型组和荷叶碱组小鼠尿液样品的1H-NMR谱图Fig.1 1H-NMR spectra of mice urine samples in blank control group，model group and nuciferine treatment group

图2 空白组、模型组和荷叶碱组小鼠血浆样品的1H-NMR谱图Fig.2 1H-NMR spectra of mice plasma samples in blank control group，model group and nuciferine treatment group

3.2.3 主成分分析 将荷叶碱作用于氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症小鼠的血浆和尿液在1H-NMR采集的数据进行PCA分析，1H-NMR数据采样模式下PCA的R2X和Q2值见表2。

表2 基于1H-NMR尿样和血浆样品的PCA参数值Tab.2 PCA parameter values based on1H-NMR urine and plasma samples

将血浆样品和尿样采集的数据进行PCA分析，制作PCA分析的得分图，如图3所示。在无监督模式的PCA分析下分组不太明显，无法明显区分不同组间的差异。然后利用有监督模式的正交偏最小二乘-判别分析进行分组比较分析。

图3 基于1H-NMR谱的尿液（A）和血浆（B）PCA分析得分图Fig.3 PCA scores plot of urine(A)and plasma(B)based on1H-NMR spectra

3.2.4 正交偏最小二乘法-判别分析 为进一步寻找给药前后荷叶碱作用于氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症小鼠的血浆和尿液的影响，本实验采用OPLS-DA统计分析模型，用来寻找差异性化学成分，并利用得分图和载荷图表示，1H-NMR数据采样模式下OPLS-DA的不同分组和样品的模型结果参数见表3，尿液和血浆样品的得分图及载荷图见图4。

表3 基于1H-NMR尿样和血浆的OPLS-DA参数值Tab.3 OPLS-DA parameter values based on1H-NMR urine and plasma samples

3.2.5 基于1H-NMR的差异化合物结果 通过统计学数据分析，选择VIP＞1的化合物作为筛选荷叶碱作用于氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症小鼠的血浆和尿液含量差异较大的化学成分，并根据候选差异化学成分在1H-NMR数据中的相对峰面积进行t检验分析，P＜0．05的数据可认为是潜在生物标志物，在血浆和尿液样品中共找到9个潜在生物标志物，9个生物标志物的变化趋势如表4所示。

图4 基于1H-NMR谱的尿液（A）和血浆（B）OPLS-DA得分图和载荷图Fig.4 OPLS-DA score plots and loading plots based on1HNMR spectrum of urine(A)and plasma(B)

表4 基于1H-NMR的潜在生物标志物Tab.4 Potential biomarkers from1H-NMR spectra

3.3 差异代谢物的通路分析 通过1H-NMR技术在血浆和尿液样品中共筛选出9个潜在生物标志物，为了进一步揭示这些差异代谢物之间的相关性，应用 metaboanalyst网站（https：//www．metaboanalyst．ca/）进行代谢通路富集分析，其中这9个潜在生物标志物均可以被数据库（KEGG，https：//www．kegg．jp/）识别，涉及到多条代谢通路，结果如图5所示，这些差异物主要涉及到酪氨酸代谢、柠檬酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢以及糖酵解和糖异生。

图5 高尿酸血症相关代谢通路图Fig.5 Metabolic map of hyperuricemia-related pathways

4 讨论

实验采用了核磁共振氢谱技术对正常对照小鼠、氧嗪酸钾诱导高尿酸血症模型小鼠，及荷叶碱给药治疗组小鼠的血浆、尿样进行了分析，实验分别考察了zgpr、cpmgpr1d及noesypr1d等脉冲序列，以及NS分别为64、160、200时的信号采集情况，同时考察了压水峰的功率PLW9分别为20、23、30、35 dB时的信号采集情况，结果表明，noesypr1d采集谱图信号较好，而且随着扫描次数的增加，血浆样品中特征峰的峰强度相应增强，但采样时间也相应增加，根据信号强度的变化并考虑实验时间等因素，最终选择采样次数为160次，通过调节预饱和压水峰的功率可以看出，当功率为23 dB时水峰的强度相对较小，对其他峰的影响也较小，样品的特征峰具有较强的峰强度和分辨率。

代谢物鉴定一般采用同核化学位移相关谱（COSY），异核单量子相关谱（HSQC），异核多键相关谱（HMBC），全相关谱（TOCSY）等常规二维谱，JRES为一种通过J调制的自旋回波将化学位移与J耦合分开，从而使一维氢谱上重叠在一起的谱峰分散在平面上，是对拥挤谱峰指认的有效方法。本实验综合了各种二维谱及J-RES谱，实现了复杂谱峰的解析，为后续代谢通路分析提供数据支持。

本实验阐明高尿酸血症涉及的9个潜在生物标志物，它们涉及酪氨酸代谢、柠檬酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢以及糖酵解和糖异生等多个途径。

精氨酸和脯氨酸代谢途径：肌酐是肌酸的中间代谢产物，是骨骼肌的能量储备，通常在肾功能受损时观察到[22]。甜菜碱广泛分布于动物，植物和微生物中，也是动物胆碱氧化的代谢产物，甜菜碱是肌酐下游的代谢产物[23]。在模型组中，肌酐、肌酸、甜菜碱的含量升高，说明肾功能遭到破坏；而荷叶碱治疗组又恢复到正常水平，表明高尿酸血症干扰了精氨酸和脯氨酸代谢途径，荷叶碱具有较好的治疗效果。

酪氨酸代谢途径：酪氨酸是生酮生糖氨基酸，苯丙氨酸4-单加氧酶（PAH基因编码蛋白）是关键酶，PAH蛋白功能可以催化苯丙氨酸转化为酪氨酸，同时，苯丙氨酸在芳香族L-氨基酸脱羧酶的作用下转化为苯乙胺，模型组中酪氨酸含量降低，而荷叶碱组的含量升高至正常水平，说明高尿酸血症使酪氨酸代谢发生紊乱。

柠檬酸代谢途径：柠檬酸是三羧酸循环的代谢产物，主要存在于线粒体中，是能量代谢的中心。柠檬酸裂解酶是柠檬酸转化为醋酸盐的关键酶，柠檬酸含量降低，醋酸盐含量升高可能是柠檬酸酶被激活，使柠檬酸加速转化为醋酸盐。琥珀酸盐是三羧酸（TCA）循环的重要中间体，位于代谢途径的十字路口。在线粒体中，它在产生三磷酸腺苷中起关键作用，在模型组中琥珀酸的含量降低，而荷叶碱组又恢复到正常水平，提示高尿酸血症使能量代谢发生异常，而荷叶碱能够纠正这种异常。

糖酵解和糖异生途径：丙酮酸是糖代谢中具有关键作用的中间产物。它可以通过乙酰辅酶A和三羧酸循环实现体内糖、脂肪和氨基酸间的互相转化，为机体提供能量。与BC相比，丙酮酸的含量在模型组中增加，表明体内的能量代谢发生紊乱。

由于实验采用核磁共振氢谱法进行检测，该方法虽然通用，但也存在一定的不足，比如高尿酸血症典型特征为尿酸的升高，而尿酸的化学结构为7，9-二氢-2，6，8（3H）三酮-1H-嘌呤，该化合物含有4个氢，均为活泼氢，在核磁共振谱上未出现信号，最终导致该化合物未被检出，这提示1H-NMR代谢组学应与其他代谢组学技术（如LC-MS、GC-MS代谢组）相结合，取长补短，最终更加全面的反应生命体代谢特征。

5 结论

荷叶具有升发清阳，凉血止血的功效，临床上主要用于治疗用于暑热烦渴，暑湿泄泻，脾虚泄泻，血热吐衄，便血崩漏等症。最近研究表明其主要成分荷叶碱具有显著降尿酸效果，但关于其药效的核磁代谢组学研究却鲜有报道。本研究首先建立基于核磁共振氢谱技术的代谢组学研究方法，分别优化了脉冲序列，采样扫描次数，预饱和压水峰脉冲功率等参数，最终确定最佳数据采集方法。在此基础上，本研究对小鼠的血浆和尿液进行代谢组学研究，较为系统地分析了氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症模型小鼠的代谢特征，同时比较了经荷叶碱治疗后的代谢物变化差异，综合运用主成分分析及偏最小二乘法判别分析等多元统计分析方法，挖掘模型组与正常组及给药组与模型组之间变化显著的差异代谢物。在化合物的鉴定方面，本研究主要采用COSY、HSQC、HMBC、TOCSY等多种核磁二维谱技术，以及J-分辨谱，最终成功鉴定了50个化合物。多元统计结果显示：从各组别中共筛选出与高尿酸血症代谢通路密切相关的9个潜在生物标志物，分别为：丙酮酸、乙酸、酪氨酸、肌酸酐、乙酰乙酸、肌酸、柠檬酸、琥珀酸，以及甜菜碱。对这些代谢物进行进一步的通路富集分析说明了高尿酸血症的病理过程主要涉及到酪氨酸代谢、柠檬酸代谢、精氨酸与脯氨酸代谢以及糖酵解和糖异生代谢途径，预示着这些潜在生物标志物不仅在早期疾病诊断中起重要作用，而且在预防高尿酸血症中也有重大意义。