线粒体动力学调控对肾缺血-再灌注损伤的影响

闫晓冬 王强

肾缺血-再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）是涉及氧化应激、炎症反应、Ca2+超载以及细胞凋亡等的病理过程，与线粒体功能障碍密切相关[1]。线粒体结构与功能的关系受线粒体动力学调控，主要表现为线粒体融合和分裂。大量研究表明，线粒体功能障碍主要表现为线粒体动力学调控机制失调[2]。线粒体结构-功能关系主要受线粒体间分裂和融合事件的分子调控，线粒体融合和分裂的动态过程被称为线粒体动力学。线粒体并不是一个静态的细胞器，其在胞内的形态和分布可根据所处的生理环境不同而改变。在不同生理条件下，线粒体可通过融合、分裂等形态学改变来适应细胞不同状态下的能量需求。线粒体融合与分裂之间的动态平衡是保护线粒体结构完整及维护细胞生物学功能的重要因素，尤其是在IRI等应激状态下，线粒体融合与分裂对细胞存活、凋亡等具有重大影响[3-4]。本文针对线粒体动力学调控在肾IRI中的作用做一综述。

1 线粒体动力学调控

线粒体动力学调控表现为融合和分裂两个过程的动态平衡，与肾IRI过程中产生的大量活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）、Ca2+和能量代谢密切相关，是影响细胞存活或死亡的重要因素。线粒体动力学的失衡，将导致细胞内环境紊乱，细胞损伤甚至死亡。线粒体动力学调控主要的蛋白表达有线粒体分裂蛋白（fission，Fis）1、视神经萎缩蛋白（optic atrophy，OPA）1、融合蛋白（mitofusin，Mfn）1、Mfn2和动力相关蛋白（dynamin-related protein，Drp）1 等[5-6]。

1.1 线粒体融合

线粒体融合是指两个不同的线粒体通过内、外膜融合成一个较大的线粒体，并进行内容物交换的过程，可为已损伤的线粒体提供呼吸链和DNA，是一种外界环境改变时线粒体的自我适应机制。Mfn1、Mfn2和OPA1是介导线粒体融合的关键介质[7]。Mfn是一种较大的三磷酸鸟苷（guanosine triphosphate，GTP）酶，位于线粒体外膜，介导外膜融合，分为Mfn1和Mfn2，二者的同源性＞75%[8]。Mfn1和Mfn2可通过相互作用发生顺式二聚化，形成Mfn1-Mfn2异源二聚体或同源二聚体，从而促使相邻线粒体外膜产生反式栓连[9-10]。Mfn二聚体的GTP酶结构域可水解GTP，引起膜构象水解，从而导致两个线粒体外膜融合。OPA1位于线粒体内膜，是一个动态的GTP酶，其主要作用是促进线粒体内膜融合和维持线粒体嵴的形态。OPA1基因缺失可致线粒体片段化，而过表达可抑制线粒体分裂，增强线粒体融合[11]。IRI严重抑制了线粒体的生物活性，而OPA1介导的线粒体融合过程可使受损线粒体之间发生交互作用，抑制线粒体碎片化并维持线粒体完整和平衡，从而抑制细胞的损伤和死亡，这种保护作用已在肝细胞、心肌细胞急性IRI模型中得到证实。Wang等[12]使用Sirt3转基因小鼠，通过转染Sirt3腺病毒使Sirt3过表达，并敲低OPA1，以探讨Sirt3-OPA1-线粒体融合在肾IRI中的具体作用。研究发现Sirt3过表达不仅可以抑制Caspase-9活性，还可增强OPA1表达，提示Sirt3-OPA1可以诱导线粒体融合，维持线粒体膜稳定，减少线粒体凋亡，减轻肾IRI。

1.2 线粒体分裂

线粒体分裂是指线粒体分成两个较小线粒体的过程。存在于细胞质中的Drp1和Fis1是介导线粒体分裂的主要蛋白。Drp1在细胞质中分散存在，当线粒体分裂被激活后，Drp1从细胞质中游离到线粒体断裂位点表面，多个Drp1分子紧紧环绕线粒体形成指环结构，水解GTP，导致线粒体内、外膜断裂，从而实现线粒体分裂[13]。分裂结束后，Drp1又回到细胞质，在细胞质与靶细胞膜之间循环[14]。Wu等[15]应用小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）敲除Drp1，结果显示Drp1敲除后线粒体形态变细长，分裂受到抑制；而Drp1过表达则可使线粒体分裂增加、细胞色素C释放及细胞凋亡，但不诱导ROS产生，证实Drp1介导的线粒体分裂与线粒体外膜渗透性的改变及其下游反应密切相关。Drp1的调控主要靠两个关键丝氨酸磷酸化位点（S616和S637），S616的磷酸化可提高Drp1的活性，而S637的磷酸化会使Drp1活性减弱[7]。此外，Fis1也作为线粒体的适配蛋白参与线粒体分裂，Fis1是由152个氨基酸构成的小分子蛋白质，是哺乳动物细胞线粒体分裂的另一个重要组成部分。Drp1作为Fis1参与线粒体分裂的主要介质，当Drp1K38A过表达抑制Drp1后，会阻断Fis1的活性，从而抑制线粒体分裂[16]，且Fis1的敲除能够抑制线粒体分裂、凋亡，但并不影响Drp1向细胞膜聚集，也不影响线粒体形态[17]。缺乏Fis1的动物细胞很少，且不会出现分裂功能缺陷[18]。国内外前期研究提示，IRI会诱发细胞线粒体启动自我分裂，导致子代线粒体大量生成，以弥补缺血条件下能量代谢的不足[19-20]。一旦线粒体过度分裂，又会破坏线粒体的形态和功能，使其呈点状、棒状碎片化，同时线粒体膜孔道开放、细胞色素C释放等共同诱发了凋亡信号的激活，介导细胞凋亡[21]。其中，Ong等[22]在2010年的一项重要研究中首次证实了线粒体分裂可参与心肌IRI，或逆转成为减轻心肌细胞损伤、保护心脏功能的关键手段。

线粒体分裂与基因调控密切相关，主要机制是影响Drp1和Fis1的表达。Din等[23]报道微小RNA（micro RNA，miRNA，miR）-499表达水平下降可促进Drp1去磷酸化，加速线粒体的片段化，从而影响心肌细胞凋亡和心肌梗死程度。有研究报道，Fis1的表达受长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）AK009271的负向调控，进而抑制了Fis1介导的线粒体分裂，影响脑IRI[24-25]。

2 线粒体功能在肾IRI中的作用

肾IRI与氧化应激、Ca2+超载、炎症损伤和线粒体功能障碍等因素密切相关，其过程会产生大量的ROS。线粒体不仅是ROS攻击的主要靶点，还是ROS产生的主要来源[26-27]。在缺血阶段，由于酸中毒的抑制作用，线粒体通透性转运孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）保持关闭状态，肾恢复供血后打开，大量的ROS进入血液和细胞，破坏机体的氧化平衡，与各种细胞结构发生反应，导致细胞氧化损伤，而线粒体是ROS攻击的主要靶点，线粒体膜的氧化反应主要发生在双键、芳香环和硫醇基中[28]。ROS通过蛋白质、脂质过氧化和DNA损伤造成细胞膜损伤，最终导致肾小管坏死[29]。相关研究提示，大量ROS可抑制Mfn2表达，促使Drp1在线粒体周边大量聚集，使线粒体表现为异常分裂及片段化，导致线粒体功能障碍，同时线粒体的这种功能改变又可再次促进ROS增多，形成恶性循环[30-31]。

肾IRI过程中的线粒体功能与Ca2+超载密切相关，线粒体在通过三羧酸循环生成三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）过程中的很多关键酶都会受到内质网Ca2+的调控，Ca2+水平升高可使氧化磷酸化过程中脱氢酶活性升高，从而促进ATP生成。线粒体Ca2+超载可使MPTP开放，启动细胞凋亡程序，导致细胞凋亡[1]。肾IRI过程中，ROS可使细胞器外膜氧化，导致细胞器外膜孔道开放，Ca2+超载与炎症因子大量释放，从而引起细胞内Ca2+失衡；降低Mfn2的表达来破坏线粒体和内质网之间的Ca2+转运连接，使线粒体对内质网Ca2+摄取减少，最终导致氧化磷酸化和ATP的生成受限[32]。Ca2+可通过介导Drp1丝氨酸结合位点去磷酸化，促进Drp1在线粒体周边聚集，进而导致线粒体片段化，破坏线粒体动力学平衡，使细胞发生凋亡[33]。

3 线粒体动力学机制对肾IRI的保护作用

在急性肾损伤或肾移植手术中，肾缺血无法避免，包括冷缺血和热缺血，冷缺血是指供肾获取后冷保存至植入受者的过程，热缺血是指供肾血流中断至冷保存前的过程。移植肾可以耐受长时间的冷缺血，并保持细胞功能不受明显损害，而热缺血则严重影响移植物功能。在公民逝世后器官捐献时代，供者经历较长热缺血时间的风险增加。肾热缺血可导致氧自由基释放、Ca2+超载、能量代谢失衡等，与线粒体动力学调控密切相关[1]。通过抑制线粒体过度分裂和（或）促进线粒体融合来调节线粒体的结构和功能，为改善和减轻IRI提供了新的途径[34]。线粒体分裂多为IRI的致病因素，抑制线粒体分裂可减轻细胞IRI。细胞分裂会加速细胞凋亡，有研究证实抑制线粒体融合也会促进细胞凋亡。Ong等[22]观察了Drp1抑制剂mdivi-1在成年小鼠心脏IRI模型中的应用效果，结果显示mdivi-1不仅可增加拉长的纤维间线粒体的比例，还可抑制心肌细胞中MPTP开放，从而导致心肌梗死范围缩小。p110是分裂蛋白Fis1和Drp1相互作用的选择性抑制剂，已有研究证实p110可减少缺血大鼠冠状动脉结扎后心肌梗死面积，防止心肌梗死后左心室重构不良，并改善心肌的血流动力学[35]。抑制Drp1的活性不仅可抑制线粒体分裂，还会抑制Caspase激活和细胞凋亡。因此，抑制线粒体分裂可有效保护细胞膜的结构稳定性以及细胞质内稳态。同时高表达Mfn1和Mfn2促进线粒体融合也可抑制细胞凋亡的进程[36]，目前相关研究在心脏、肝脏研究报道相对较多，但肾IRI与线粒体动力学相关研究报道较少。Wang等[12]在小鼠IRI模型中证实了线粒体调控机制（Sirt3-OPA1-线粒体融合）可有效减轻炎症反应、维持氧化还原平衡、增强线粒体内Ca2+调节能力、阻断线粒体触发的细胞坏死等。

4 小结与展望

综上所述，线粒体在IRI等应激状态下，极易发生损伤，导致功能紊乱。线粒体分裂和融合之间的动力学调控机制已在肝脏细胞、心肌细胞急性IRI模型中得到证实。维持线粒体动力学的稳态可成为减轻急性IRI新的研究方向，可能成为新的药物作用靶点。线粒体动力学调控与肾IRI密切相关，研究线粒体动力学调控对肾IRI的影响，对肾移植过程中肾脏保护方案的研究具有重要的理论及现实意义。