PM2.5对AECOPD和ACO患者血清作用的肺泡巨噬细胞炎症的影响及其机制*

王晓彤 ， 袁关利， 王 正， 武思羽， 周广伟 ， 刘新秀，李 静， 阎锡新， 孟爱宏△

（1河北医科大学第二医院北院区呼吸与危重症医学科，河北石家庄050004；2河北医科大学，河北石家庄050011；3秦皇岛市第一医院，河北秦皇岛066099；4河北医科大学第二医院呼吸与危重症医学一科，河北石家庄050004）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）简称慢阻肺，是随时间进展进行性加重的气道炎症疾病，同时患COPD 及哮喘这两种病称为哮喘-慢阻肺重叠（asthma-COPD overlap，ACO）。细颗粒物（particulate matter，PM）是空气污染物的重要成分，PM2.5 的长期有害刺激可导致慢性炎症反应，会损坏肺内正常的修复和防御机制，引起肺泡巨噬细胞等被激活，放大气道内炎症反应，损伤肺组织，造成疾病加重［1］。沉默信息调节因子2相关酶 1（silent information regulator 2-related enzymes 1，SIRT1）是III 型蛋白去乙酰化酶，是一种参与调节细胞衰老和炎症的蛋白。有研究显示，SIRT1 参与PM 诱导的气道炎症病［2］，NF-κB 是 SIRT1 的底物之一，SIRT1 的激活可抑制 NF-κB 的活性，从而减少NF-κB 转录诱导的凋亡［3］。但 PM2.5 与 SIRT1/NF-κB信号通路的作用关系尚不清楚。

本研究利用AECOPD和ACO患者血清刺激小鼠肺泡巨噬细胞（MH-S 细胞），建立局部炎症体外模型，用PM2.5刺激炎症体外模型，探讨PM2.5刺激对AECOPD 及ACO 血清孵育的巨噬细胞的影响。并进一步应用SIRT1 激活剂SRT2104 及SIRT1 特异性抑制剂 EX527 作用 MH-S 细胞，检测 SIRT1 和 NF-κB P65、p-P65、IκB 和 p-IκB 的蛋白水平及白细胞介素 6（interleukin-6，IL-6）和 IL-10 含 量 的 变 化 ，探 究PM2.5 致巨噬细胞炎症与SIRT1/NF-κB 信号通路的关系。

材料和方法

1 实验材料

1.1 实验细胞 永生化小鼠肺泡巨噬细胞株MH-S细胞购自ATCC，由实验室常规传代培养。

1.2 主要材料与试剂 AECOPD 及ACO 患者血清取自河北医科大学第二医院北院区呼吸与危重症医学科住院患者。一般资料比较见表1。PM2.5 由河北医科大学第二医院呼吸与危重症一科赠送。IL-6和IL-10 ELISA 试剂盒购自北京四正柏生物科技有限公司；CCK-8 细胞活力检测试剂盒购自东仁化学科技（上海）有限公司；兔抗小鼠P65、p-P65、IκB、p-IκB 和 SIRT1 多克隆抗体均购自 Cell Signaling Technology；SRT2104 及EX527 购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.3 实验仪器 Mk3 全自动酶标仪（ThermoLabsystems）；共聚焦显微镜（Carl Zeiss AG）；TLL-C 台式高速冷冻离心机（北京四环科学仪器厂）；电泳仪（北京六一仪器厂）；Gene Company Limited扫描仪。

2 实验方法

2.1 PM2.5 悬液的制备 收集石家庄地区2019 年11月～2020年2月雾霾，收集结束后将载有PM2.5的滤膜剪成碎片并浸入蒸馏水中，利用超声震荡器反复震荡，三层无菌纱布过滤，滤液12 000 r/min、4 ℃离心20 min，去上清，干燥，待用。临用前称取5 mg PM2.5，溶于1 mL DMSO 液配成5 g/L 颗粒物悬液，使用0.22 μm滤器过滤除菌，-20 ℃保存待用。

表1 AECOPD患者及ACO患者的一般资料比较Table 1. Comparison of general data between AECOPD patients and ACO patients（Mean±SD. n=12）

2.2 细胞的培养及收获 常规培养MH-S 细胞，瓶中加入配制好的培养基4 mL，将培养瓶放置在含5%CO2的37 ℃培养箱中培养。观察MH-S 细胞生长情况，当单层细胞处于对数生长期时，进行相关实验。

2.3 CCK-8 法检测细胞活力 本课题组前期已测定PM2.5 的刺激浓度为100 mg/L，血清的最适刺激浓度为1%，依此浓度进行实验［4］。CCK-8 检测确定PM2.5 及 AECOPD 和 ACO 患者血清刺激后 MH-S 细胞存活率大于80%的作用时间。取对数生长期的MH-S 细胞，调整细胞浓度为 4×107/L，接种至 96 孔板，每孔100 μL，培养过夜，按对照组、PM2.5组、AECOPD 组（1% AECOPD 患者血清处理）、ACO 组（1%ACO 患者血清处理）、PM2.5+AECOPD 组和PM2.5+ACO 组进行分组干预，干预时间为6、9、12 h。干预完成后向每孔加入10 μL CCK-8 溶液。继续培养2 h，用酶标仪测定450 nm 处的吸光度（A）度，进行细胞活力计算。

2.4 ELISA 检测细胞上清液中IL-6 和IL-10 的浓度 调整细胞浓度为2.5×108/L，培养过夜。实验分为6 组：（1）对照（control）组：加入与实验组等量的RPMI-1640 培养基；（2）PM2.5 组：加入 RPMI-1640培养基及PM2.5（终浓度为100 mg/L）；（3）AECOPD组：加入RPMI-1640 培养基、AECOPD 患者血清（终浓度为 1%）；（4）ACO 组：加入 RPMI-1640 培养基、ACO 患者血清（终浓度为1%）；（5）PM2.5+AECOPD组：加入 RPMI-1640 培养基、1% AECOPD 患者血清及PM2.5（终浓度为 100 mg/L）；（6）PM2.5+ACO 组：加入RPMI-1640 培养基、1%ACO 患者血清及PM2.5（终浓度为100 mg/L）。按上述分组方法进行干预，干预时间为6 h。干预完成后收集细胞上清液，利用IL-6 和 IL-10 ELISA 检测试剂盒检测 IL-6、IL-10 的浓度，实验严格按照说明书进行操作。

2.5 Western blot检测 SIRT1、P65、p-P65和IκB和p-IκB的蛋白水平 调整细胞浓度至1×109/L，于6孔板培养过夜，本实验分为4 组：（1）对照组：加入与实验组等量的RPMI-1640 培养基；（2）PM2.5 组：培养基中加入PM2.5，使其终浓度为100 mg/L；（3）PM2.5+SRT2104 组：培养基中加入SRT2104（3 μmol/L，提前12 h 加入）和 PM2.5（终浓度为 100 mg/L）；（4）PM2.5+EX527 组：培养基中加入 EX527（3 μmol/L，提前12 h 加入）和PM2.5（终浓度为 100 mg/L）。按上述方法分组干预12 h。干预完成后收集细胞及细胞上清液。细胞内加入RIPA 裂解液，冰上裂解30 min 后离心提取蛋白质，BCA 试剂盒进行蛋白质定量，经SDS-PAGE，转膜、封闭、抗体孵育后进行条带扫描，灰度量化分析。细胞上清液IL-6 和IL-10 检测方法同前。

3 统计学处理

应用SPSS 26.0 软件将测出的数据进行统计学分析，所有统计指标均进行正态性检验，结果以均数±标准差（mean±SD）表示。两样本比较采用t检验；多组间比较行单因素方差分析并运用SNK-q检验进行组间两两比较。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 CCK-8法测定MH-S细胞活力的结果

PM2.5 刺激 MH-S 细胞 6、9 和 12 h，细胞存活率分别为（89.86±10.22）%、（87.8±4.87）%和（82.32±6.42）%；1% AECOPD 患者血清刺激 MH-S 细胞 6、9和 12 h，细 胞 存 活 率 分 别 为（86.99±4.89）% 、（71.38±5.87）%和（58.91±13.46）%；而 1% ACO 患者血清刺激 MH-S 细胞 6、9 和 12 h，细胞的存活率分别为（83.26±10.26）%、（68.43±5.72）%和（46.58±6.78）%。刺激时长为6 h 时，细胞存活率均大于80%，且细胞存活率无统计学差异。

2 AECOPD 和 ACO 患者血清及 PM2.5 刺激 MHS细胞后IL-6和IL-10的变化情况

与对照组相比，PM2.5 组、AECOPD 组、ACO 组、PM2.5+AECOPD 组和PM2.5+ACO 组细胞上清中的IL-6 浓度均升高、IL-10 浓度均降低。ACO 组较AECOPD 组 IL-6 升高、IL-10 降低更明显（P＜0.05），与PM2.5+AECOPD 组相比，PM2.5+ACO组IL-6升高更明显（P＜0.05），IL-10的变化不明显，见表2。

表2 AECOPD 和 ACO 患者血清及 PM2.5 刺激 MH-S 细胞后细胞上清中IL-6和IL-10的变化Table 2. Changes of IL-6 and IL-10 in supernatant MH-S cells stimulated with PM2.5 and serum of AECOPD and ACO patients（ng/L. Mean±SD. n=12）

3 PM2.5致巨噬细胞炎症与SIRT1/NF-κB的关系

PM2.5刺激细胞12 h后，SIRT1的表达减少，IκB和p-IκB 的蛋白水平减少，p-P65 的蛋白水平增加（P＜0.05），加入 SIRT1 激活剂 SRT2104 后，SIRT1 表达增加，p-P65 蛋白水平降低，IL-6 浓度降低和 IL-10 升高（P＜0.05）；加入SIRT1 抑制剂EX527，SIRT1 的表达减少，p-P65的蛋白水平增加，IL-6浓度升高，IL-10浓度降低（P＜0.05），见图1、表3。

讨 论

COPD 与ACO 均是呼吸系统的慢性气道炎症疾病，PM2.5 暴露可以增加炎性细胞的数量及炎症因子的表达，与慢性气道炎症疾病的发病相关，深入研究PM2.5 对AECOPD 和ACO 患者局部炎症的影响对揭示疾病发生机制尤为重要。

本实验通过检测IL-6 的表达发现，单纯PM2.5刺激即可导致 IL-6 的表达增加，这与 Li 等［5］研究一致。而利用AECOPD 和ACO 患者血清与PM2.5 共同刺激MH-S 细胞，IL-6 的表达增加更为明显，可见PM2.5可以进一步加重AECOPD 及ACO患者的局部炎症反应，促进炎症介质的大量释放。通过AECOPD组与ACO 组比较发现，同时加或不加入PM2.5刺激，ACO 组IL-6的表达水平均高于AECOPD 组，由此可认为ACO患者的局部炎症反应较AECOPD更为明显。Ghosh 等［6］也做了相似的研究发现，与哮喘和AECOPD 相 比 ，IL-1β、IL-17E、GM-CSF、IL-18、NGAL、IL-5、IL-10、MCP-1、YKL-40、IFN-γ、IL-6 和TGF-β 等13 种免疫介质在ACO 中均有明显表达。这些标志物相互之间以及与肺功能参数之间具有显著的相关性。

本实验检测不同组别IL-10 的表达发现，PM2.5组IL-10 的表达较对照组明显下降，但AECOPD 组和ACO 组的表达与对照组相比差异无统计学显著性，说明PM2.5 刺激对巨噬细胞的作用更明显，徐佳莉等［7］的研究也有类似的发现。而PM2.5+ACO 组和PM2.5+AECOPD 组表达量较PM2.5 组明显减低，可见单独血清刺激对巨噬细胞无明显作用，但血清联合PM2.5刺激可显著影响IL-10的表达。综上所述，PM2.5 作为大气污染物，可以诱导巨噬细胞M1 炎症表型增加，增加IL-6 的水平，而M2 表型减少，降低IL-10 的水平。PM2.5 对小鼠肺泡巨噬细胞极化为炎症表型和引发肺部炎症有相当大的影响［8］。

SIRT1 是一种依赖NAD+的脱乙酰酶，它通过组蛋白脱乙酰化调节基因表达，在多种疾病的病理、进展和治疗中起着复杂的作用。有实验发现，PM2.5暴露可显著降低体内外SIRT1 的蛋白水平，加重呼吸氧化损伤［9-10］。NF-κB 是机体中重要的细胞转录因子，在静息条件下，NF-κB 和 IκB 蛋白形成一个复杂的三聚体，以不活跃的形式存在于细胞质中。在受到各种刺激之后，IκB 激酶介导可使 IκB 蛋白磷酸化和泛素化，导致其随后的降解和NF-κB 的核易位，从而触发相应靶基因的转录［11］。在PM2.5 的刺激下，NF-κB 信号通路可被诱导激活，加重炎症反应，引起呼吸系统损伤［12-13］。SIRT1 可以直接或间接抑制NF-κB信号通路，NF-κB系统通过抑制SIRT1下游靶点来抑制SIRT1 介导的功能。本实验利用PM2.5刺激 MH-S 细胞发现，IκB、p-IκB 和 SIRT1 的蛋白水平减少，p-P65 的蛋白水平高于对照组，说明NF-κB被活化上调，SIRT1和NF-κB均参与了PM2.5致巨噬细胞炎症的过程。

SRT2104 是一种新型SIRT1 激活剂，可以减轻PM2.5 诱导的 M1 反应，此外，SRT2104 可以降低肺气肿的病理特征，改善肺功能参数，对暴露于香烟烟雾和气管内脂多糖灌注所致的肺气肿大鼠体内AECII 细胞凋亡具有抑制作用［14］。本实验研究了SRT2104 对 PM2.5 刺激的 MH-S 细胞的作用发现，加入SRT2104后，SIRT1、IκB 的蛋白水平较单独PM2.5刺激时增加，p-P65 则降低，可见SRT2104 可能通过上调SIRT1，抑制了NF-κB的活化。本研究结果与部分学者的研究结果一致［15-16］。EX527 是 SIRT1 的抑制剂，为了进一步验证PM2.5 的致炎作用与SIRT1/NF-κB 的关系，本研究利用 PM2.5 与 EX527 共同刺激 MH-S 细胞，与 PM2.5 组相比，SIRT1 的表达较单独PM2.5 刺激组下降，p-P65 的水平升高，抑制SIRT1 的表达可以进一步增强NF-κB 的活化。检测各组 IL-6 和 IL-10 的浓度发现，PM2.5+SRT2104 组IL-6 的浓度较 PM2.5 组明显下降，PM2.5+EX527 组IL-6的浓度明显升高，可见激活SIRT1可减轻促炎因子IL-6 的释放，抑制SIRT1 的表达可加重PM2.5 刺激的促炎因子IL-6 的释放。同时，PM2.5 组、PM2.5+SRT2104 组、PM2.5+EX527 组 IL-10 的浓度较对照组均明显下降，PM2.5+SRT2104组IL-10浓度较 PM2.5 组 增 加 ，PM2.5+EX527 组 IL-10 浓 度 较PM2.5 组减少，可见PM2.5 的刺激可以抑制抑炎因子IL-10 的表达，加入SIRT1 激活剂可增加IL-10 的表达，加入SIRT1抑制剂后，IL-10的表达进一步被抑制。由此可以认为，SIRT1/NF-κB 通路是 PM2.5 致巨噬细胞炎症的途径之一，但其内部的分子机制仍需进一步深入研究来阐明。

Figure 1. Comparison of the protein levels in each group. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs PM2.5 group.图1 各组蛋白表达差异的比较

表3 各组IL-6和IL-10的表达情况Table 3. Expression of IL-6 and IL-10 in each group（ng/L.Mean±SD. n=12）

综上所述，本研究利用PM2.5建立了MH-S细胞的炎症体外模型，利用SIRT1 特异性激活/抑制剂证实了SIRT1/NF-κB 在PM2.5 致巨噬细胞炎症中的作用，本研究结果为说明PM2.5 致巨噬细胞炎症的作用机制提供了证据，但本研究的不足之处在于只进行了细胞水平的体外研究，缺乏体内模型的验证，需在今后的研究中进一步完善说明。