CaMKII/NFAT通路激活可促进AKI小鼠肾小管上皮细胞凋亡*

黄宗顺， 肖 洁， 彭用华， 俞小敏， 陈亚琦

（广州医科大学附属第一医院肾内科，广东广州510120）

急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是肾功能在短期内下降而出现的氮质废物滞留和尿量减少的综合征。AKI 具有全球发病率高、预后不良和医疗费用高等严峻问题［1-6］。目前，AKI 的发病机制尚未明确。肾小管上皮细胞（renal tubular epithelial cells，RTEC）凋亡是AKI 发生发展的重要病理改变之一，明确RTEC 凋亡的分子机制对AKI的防治具有重要意义。钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（calcium/calmodulin-dependent protein kinase II，CaMKII）是广泛表达于各种组织的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，与细胞凋亡密切相关［7-9］。CaMKII 在氧化应激损伤和细胞凋亡中发挥重要作用，敲除CaMKII基因或抑制其功能可缓解内质网应激诱发的心肌细胞凋亡［10］。也有研究认为，CaMKII 过表达可促进碘海醇诱导的线粒体损伤和 RTEC 凋亡［7］。目前，CaMKII 是否参与AKI 的发病及其在RTEC 凋亡中的机制仍未明确。因此，本研究采用阿霉素（adriamycin，ADR）干预人近端肾小管上皮细胞HK-2 和BALB/c 小鼠，分别建立 RTEC 凋亡细胞模型和 AKI 动物模型［11-12］；采用Western blot、流式细胞术和细胞转染等技术，初步探讨CaMKII 和活化T 细胞核转录因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）在 AKI 的 RTEC 凋亡中的作用和调控机制。

材料和方法

1 实验材料

1.1 细胞培养与分组 肾小管上皮细胞HK-2（购自ATCC）用含10%胎牛血清（Gibco BRL）的RPMI-1640 培养液（Gibco BRL）在37 ℃培养箱中培养。培养成熟的RTEC 予ADR（0.062 5 mg/L；购自Sigma）、KN-93 磷酸盐（简写为K；CaMKII 的特异性抑制剂；2 μmol/L；购自Selleck Chemicals）、钙调蛋白（calmodulin，CaM；CaMKII 活化剂；5 μmol/L）或siRNA（50 nmol/L）干预24 h。培养成熟的RTEC 按实验内容随机分组。第1～3 部分实验分为3 组：正常对照（control，Con）组、ADR 组和 ADR+K 组。第 4 部分实验分为 6 组：Con 组、siRNA 空白对照（siRNA blank control，siCon）组、ADR 组、ADR+NFAT-siRNA（siNFAT）组和CaM 组和CaM+siNFAT 组。siNFAT（序列为 5′-GCCATAACTTTCTGCAAGA-3′）和siCon 购自广州锐博公司。siRNA 的细胞转染方法详见我们的前期研究［12-15］和产品说明书。

1.2 实验动物分组与干预 18 只 SPF 级 6～8 周龄18～21 g 的雌性BALB/c 小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号为SCXK（京）2016-0006。按每组 6 只小鼠随机分为 3 组：Con 组、ADR组和ADR+K 组。动物实验伦理通过广州医科大学附属第一医院伦理委员会的审查。12只小鼠在实验前 1 d 尾静脉注射 ADR（12 mg/kg），6 只 Con 组小鼠尾静脉注射相同体积的生理盐水。其中6 只注射ADR 的小鼠在实验第 1、3、5 天予腹腔注射 K（0.08 mg/kg）。因造模时小鼠意外死亡2只，最后入组情况为每组5 只。小鼠在第7 天予氯胺酮（70 mg/kg 腹腔注射）麻醉后处死，取动脉血提取血清行酶联免疫吸附实验，肾脏组织用于提取蛋白行免疫印迹实验。

2 方法

2.1 Western blot 具体步骤详见我们的以往研究［12-15］。简述如下：按照核浆蛋白提取试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）说明提取总蛋白、核蛋白与胞浆蛋白。BCA 法测量各样品的蛋白浓度。蛋白变性后以每个电泳道上样30 μg 进行SDS-PAGE。转膜后剪下目的条带，用5%脱脂奶粉室温条件下封闭1 h 后，加相应Ⅰ抗4 ℃摇床孵育过夜。次日洗去Ⅰ抗后加Ⅱ抗室温摇床孵育1 h，用TBST 洗条带3次，每次5 min。ECL 发光液显影、拍照。实验所用Ⅰ抗体如下：兔抗p-CaMKII（Cell Signaling Technology，1∶1 000），兔抗t-CaMKII（Santa Cruz，1∶500），兔抗NFAT（Cell Signaling Technology，1∶1 000），兔抗Bcl-2（Cell Signaling Technology，1∶1 000），兔抗Bax（Cell Signaling Technology，1∶1 000），兔抗 GAPDH（Bioworld Technology，1∶10 000），兔抗 histone（Cell Signaling Technology，1∶3 000）。蛋白表达定量以目标蛋白/GAPDH或目标蛋白/histone（核蛋白）表示。

2.2 流式细胞术 具体实验步骤见我们以往研究［12-15］，各组 RTEC 的细胞凋亡率严格按照 Annexin V/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡检测试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）的说明执行。简述如下：以磷酸缓冲盐溶液洗净各组HK-2 细胞，0.05%胰酶消化细胞使其从培养皿脱落，用含5%胎牛血清的培养液终止消化。冷磷酸缓冲盐溶液洗净HK-2 细胞后离心管收集约5×105细胞。用结合缓冲液（Binding Buffer）重悬HK-2 后转移至流式管。先后加Annexin V-FITC（染凋亡细胞）和PI 混匀。室温避光条件下孵育10 min。最后在1 h 内用流式细胞仪检测各标本的细胞凋亡率。

2.3 酶联免疫吸附实验 各组小鼠的血清肌酐检测严格按照小鼠肌酐检测试剂盒（Cayman Chemical）的说明执行。简述如下：准备各梯度浓度的标准品。酶标板上设空白孔、标准孔和待测样品孔，加入各标准品或样品15 μL。每孔再加150 μL 碱性苦味酸溶液。室温摇床孵育10 min。用酶标仪492 nm 波长下测各孔吸光度（A1）。每孔加入5 μL 酸性溶液。室温摇床孵育20 min。再次用酶标仪测各孔的A值（A2）。计算公式：A3=A2-A1，校正A=各孔A3-空白孔A3。以标准品的校正A作图，浓度值为 X 轴，校正A为 Y 轴，绘制标准曲线。用各样品的校正A在标准曲线上查出相对应的肌酐浓度。

3 统计学处理

所有数据以均数±标准误（mean±SEM）表示。用统计软件SPSS 21.0 进行统计分析。所有实验重复至少 3 次。两组间比较用Student′st检验，多组间比较用单因素方差分析及Bonferroni 或Tamhane′s T2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 CaMKII活性在ADR干预的RTEC中升高

Western blot 结果显示，对比正常培养的RTEC，ADR 干预的 RTEC 中 CaMKII 蛋白磷酸化程度，即CaMKII 活 性（p-CaMKII/t-CaMKII）显 著 增 加（P＜0.01），见图1A；同时，在ADR 干预的小鼠肾组织中CaMKII活性也显著增加（P＜0.01），见图1B。

Figure 1. CaMKII activity was increased in ADR-injured RTEC. A：Western blot showed that the CaMKII activity（the ratio of p-CaMKII/t-CaMKII）was increased in ADR-injured HK-2 cells；B：the CaMKII activity was increased in kidney tissues of ADR-treated mice. Mean±SEM. n=5.**P＜0.01 vs control（Con）group.图1 CaMKII活性在ADR干预的RTEC中增高

2 抑制CaMKII 活化可减少ADR 诱导的RTEC 凋亡，抑制血清肌酐升高

流式细胞术分析显示，对比Con 组，ADR 组细胞凋亡率显著升高（P＜0.01），用K 抑制CaMKII 活化后细胞凋亡率显著降低（P＜0.05），见图2A。与此一致地，如图 2B、C 所示，对比 Con 组，ADR 干预的 HK-2细胞和小鼠肾组织中促凋亡蛋白Bax 的表达显著增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达显著减少（P＜0.05），抑制CaMKII 活化后此作用显著减弱（P＜0.05）。此外，如图2D 所示，对比正常小鼠，ADR 干预小鼠血清肌酐显著升高（P＜0.05），予K 后血清肌酐显著下降（P＜0.05）。

3 抑制CaMKII 活化可减少ADR 诱导的核NFAT蛋白增加

Western blot 结果显示，对比正常 RTEC，ADR 损伤的HK-2 细胞中，核蛋白NFAT 显著增加（P＜0.01），用K 抑制CaMKII 活化后此作用显著减弱（P＜0.05），见图3A；同时，对比正常小鼠，ADR 干预小鼠肾组织中核蛋白NFAT 显著增加（P＜0.01），予K 后此作用显著减弱（P＜0.05），见图3B。

Figure 2. Inhibition of CaMKII activity attenuated ADR-induced RTEC apoptosis. A：cultured HK-2 cells were stained with Annexin V/PI for flow cytometry analysis；B：Western blot showed that Bax protein expression was increased，and Bcl-2 was decreased in ADR-injured HK-2 cells，but inhibition of CaMKII activity by KN-93（K）attenuated these changes；C：Bax protein expression was increased and Bcl-2 was decreased in kidney tissues of ADR-treated mice，but inhibition of CaMKII activity by K attenuated these changes；D：serum creatinine was increased in ADR-treated mice，but it was back to nearly normal after inhibiting CaMKII activity by K in ADR-treated mice. Mean±SEM. n=5.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control（Con）group；#P＜0.05 vs ADR group.图2 抑制CaMKII活化可减轻ADR诱导的RTEC凋亡

4 CaMKII可通过NFAT促进RTEC凋亡

流式细胞术结果显示，对比Con 组或siCon 组，ADR 或 CaM 干预 的 RTEC 凋亡率显 著 升高（P＜0.05）；但在 ADR 或 CaM 干预 RTEC 的同时，加上siNFAT 处理后细胞凋亡率显著降低（P＜0.05），见图4。

Figure 3. Inhibition of CaMKII activity attenuated ADR-induced increase in nuclear NFAT expression. A：Western blot showed that nuclear protein expression of NFAT was significantly increased in ADR-injured HK-2 cells，but inhibition of CaMKII activity by KN-93（K）attenuated this change；B：nuclear protein expression of NFAT was significantly increased in kidney tissues of ADR-treated mice，but inhibition of CaMKII activity by KN-93（K）attenuated this change. Mean±SEM. n=5.**P＜0.01 vs control（Con）group；#P＜0.05 vs ADR group.图3 抑制CaMKII活化可减少ADR诱导的核NFAT蛋白增加

讨 论

AKI 严重时可引起严重电解质酸碱紊乱、感染、心衰、肺水肿、昏迷，甚至死亡。AKI 的发病率和死亡率较高［16-17］，是危害人类健康的常见急重症之一，在发展中国家造成严重的医疗和经济负担［18-19］。AKI 的早期表现、危险因素和致病机制缺乏认识，常导致AKI 的防治不足，可加速患者病情进展，带来更严重的肾脏损伤、多器官损害和更高的死亡风险［18］。明确AKI 早期发病的分子机制，有助于疾病的早期识别和药物干预。AKI 病因可分为肾前性、肾性和肾后性损伤；其中，肾前性主要是肾灌注减少诱发，肾后性多是尿路梗阻所致；而肾性损伤的病因最为繁多和复杂，包括肾小管、肾间质、肾血管和肾小球的损伤，尤以肾小管的损伤最为多见。RTEC 凋亡是导致肾性AKI 发生发展的重要原因。因此，明确RTEC 凋亡的分子机制有可能为AKI 防治提供参考资料。

丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶CaMKII 在各组织广泛表达，与细胞凋亡密切相关［9-10］。药物抑制或基因敲除CaMKII可保护内质网应激诱发的小鼠心肌细胞凋亡［10］。体外研究表明CaMKII 过表达可促进碘海醇诱导的线粒体损伤和RTEC 凋亡［7］。这可能与CaMKII 下游的CypD/mPTP 通路异常激活促进RTEC损伤有关［7］。在上述研究的基础上，为探索AKI 中CaMKII 在RTEC 凋亡中作用和分子机制，我们首先采用ADR 干预体外RTEC和小鼠，结果显示RTEC凋亡率和小鼠血清肌酐显著升高，这与以往研究结论一致［12-13］，提示 RTCE 凋亡模型和 AKI 模型构建成功。ADR 干预后HK-2 细胞和小鼠肾组织中CaMKII活性显著增加；抑制CaMKII 活性后，HK-2 细胞凋亡和小鼠肾组织细胞凋亡减轻，小鼠血清肌酐水平回降。上述结果提示CaMKII 异常激活可促进AKI 中RTEC凋亡。

NFAT 是钙调磷酸酶（calcineurin，CaN）的底物，是Ca2+依赖的转录因子。NFAT作为Ca2+/CaM信号通路的下游分子起到促进细胞凋亡的作用［20-21］。高糖刺激下NFAT 核蛋白表达水平显著升高，抑制CaN/NFAT 通路后可显著减轻高糖损伤诱导的肾小球足细胞凋亡［22-24］。此外，Ca2+/CaM 信号下游的 CaMK/CREB 通路也可激活 NFAT 功能［26］。既往研究提示CaMKII 和NFAT 有可能存在相互作用，共同参与调控RTEC凋亡。据此，本研究深入探索上述分子在早期AKI 致病中的作用机制。我们观察到活化剂干预激活CaMKII 后，体外模型中RTEC 细胞凋亡率显著升高，但在沉默NFAT后，细胞凋亡率显著降低。在ADR 损伤的RTEC 和小鼠肾组织中，核蛋白NFAT 显著升高伴随RTEC 凋亡增加，而在抑制CaMKII 活化后核蛋白NFAT 回降且细胞凋亡率降低。上述结果提示CaMKII 可通过调控NFAT 促进小鼠RTEC凋亡。

综上所述，本研究建立了人RTEC 凋亡模型和AKI 小鼠模型，并在模型中观察到CaMKII 可通过NFAT促进小鼠RTEC凋亡。这有可能为AKI防治提供参考资料。

Figure 4. CaMKII promoted RTEC apoptosis through NFAT. A：total NFAT protein expression was knockdown to about 45% in NFAT-siRNA（siNFAT）-treated HK-2 cells；B：apoptosis rate was significantly increased in ADR- or calmodulin（CaM；CaMKII activator）-injured HK-2 cells compared with control（Con）or siRNA blank control（siCon）group，but apoptosis was significantly alleviated by siNFAT in ADR- or CaM-injured HK-2 cells. Mean±SEM. n=4.*P＜0.05 vs Con or siCon group；#P＜0.05 vs ADR group；△P＜0.05 vs CaM group.图4 CaMKII通过NFAT促进RTEC凋亡