丹蒌片通过铁死亡途径减轻非酒精性脂肪性肝病模型小鼠肝脏氧化损伤*

张 新， 陈文娜， 宋 囡， 朱敬轩， 刘雨彤

（辽宁中医药大学 1研究生院，2医学检验学院，辽宁沈阳110000）

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一种临床常见的代谢性疾病，主要特征为除酒精以外的其他因素引起的肝细胞脂肪变性，其已经成为21 世纪全球公认的公共健康问题之一［1］。近年来，随着居民饮食结构的变化，NAFLD的发病率呈现逐年上升且年轻化的趋势。流行病学调查研究表明，NAFLD的全球患病率约为24%，严重危害了人类的健康［2］，因此积极寻求治疗NAFLD 的药物至关重要。由于中草药副作用较弱，且疗效较好，使得中草药成为人们寻求来治疗NAFLD 的理想药物。近来的研究多采用高脂喂饲ApoE-/-小鼠制备NAFLD 模型来探讨铁死亡在NAFLD 模型中的作用机制［3-4］。研究显示，铁死亡与脂代谢类疾病密切相关，铁死亡可能是导致NAFLD 发生的重要病理机制之一［5］。铁死亡是一种不同于坏死、凋亡和自噬等的新型程序性死亡方式，其主要病理特征为Fe2+催化的芬顿化学反应促进了脂质过氧化的发生，引起细胞氧化损伤破坏细胞膜导致细胞死亡［6］。

丹蒌片主要是由川芎、丹参、瓜蒌、薤白、葛根、赤芍、郁金、骨碎补、泽泻和黄芪十味中药组成，以益气通阳、化瘀散结功效组方。方中瓜蒌、薤白、骨碎补和郁金有降低血脂水平和抗动脉粥样硬化等作用［7-8］；泽泻、黄芪和葛根有抗氧化应激损伤保护血管内皮细胞作用［9-10］；丹参、川芎和赤芍有改善降低毛细血管通透性、改善血液流变、调节血小板抗凝功能、降低血液黏度等作用［11］。同时，现代药理学研究表明，丹蒌片也有降低血脂水平、改善血管内皮功能、肝脏脂质沉积及治疗动脉粥样硬化等作用［12］。但丹蒌片能否通过铁死亡途径调节NAFLD 模型小鼠肝脏氧化损伤，以往研究中却鲜有报道。故本研究采用高脂饲料饲喂ApoE-/-小鼠的方法复制NAFLD模型，探讨丹蒌片通过铁死亡途径调节NAFLD 模型小鼠肝脏氧化损伤的机制，以期为治疗NAFLD 的深入研究提供实验依据。

材料和方法

1 实验动物

SPF 级ApoE-/-雄性小鼠 16 只，C57BL/6J 小鼠 8只，8 周龄，体质量18～22 g，均购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号为SCXK（京）2012-0001。饲养于全封闭SPF级状态下的辽宁中医药大学实验动物中心，保证动物自由进食与饮水。动物实验经辽宁中医药大学动物伦理委员会批准，并按照《实验动物饲养管理和使用指南》进行。

2 试剂与仪器

丹蒌片（吉林康乃尔药业有限公司）；总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）测定试剂盒（四川迈克生物科技股份有限公司）；丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）试剂盒（南京建成生物有限公司）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、肿瘤坏死因子α（tumornecrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）和Fe2+检测试剂盒（Elabscience）；铁反应元件结合蛋白2（iron-responsive element-binding protein 2，IREB2）和铁蛋白重链 1（ferritin heavy chain 1，FTH1）抗体（Immunoway）；谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）抗体（Abcam）；引物（Sangon Biotech）。Tanon 5200 化学发光成像系统（上海天能科技有限公司）；AU5800 全自动生化分析仪（Beckman Coulter）；电泳槽和转膜仪（Bio-Rad）；实时荧光定量PCR仪（Applied Biosystems）。

3 主要方法

3.1 模型制备、分组及干预 取16只ApoE-/-小鼠随机分为模型（model）组和丹蒌片组，每组8 只，另取8只C57BL/6J 小鼠作为正常对照（control）组。适应性喂养1 周后，正常对照组每日饲喂基础饲料，模型组和丹蒌片组每日给予高脂饲料喂饲8 周，之后每组随机抽取2只ApoE-/-小鼠解剖观察小鼠肝脏特征，同时多聚甲醛固定后 HE 染色［13-14］。确定 NAFLD 造模成功后，丹蒌片组参考人和动物体表面积折算的等效剂量比率表换算小鼠每日需用量为680 mg/kg，于是丹蒌片组小鼠按照680 mg·kg-1·d-1连续灌胃干预4周，正常对照组和模型组给予等体积生理盐水灌胃4周［15-16］，12周后取材并置于-80 ℃冰箱保存。

3.2 小鼠血脂、AST 和ALT 检测水平 利用眼球采血法收集小鼠血液，置于含有4%柠檬酸钠抗凝管中静置 30 min 后，594×g离心 25 min 后，按照试剂说明书步骤操作检测血清LDL-C、HDL-C、TC、TG、AST 和ALT水平，最后对数据进行统计分析。

3.3 HE 染色观察肝组织的病理形态 将小鼠肝脏固定于4%多聚甲醛中72 h，按常规HE 染色方法进行染色。组织经梯度脱水、透明后进行石蜡包埋，切片；之后经二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水后，苏木精染色、70%盐酸乙醇分化、伊红复染，再次梯度乙醇脱水、二甲苯透明后中性树胶封片，光镜下观察肝组织形态。

3.4 油红O 染色观察肝脏脂质沉积 将各组小鼠肝脏依次放入15%和30%的蔗糖中脱水，OCT 包埋做成冰冻切片，油红O 染色10 min，75%的乙醇分化，水洗后苏木素复染，流水冲洗，甘油明胶封片，光镜下观察肝脏脂质沉积情况。

3.5 比色法检测各组小鼠肝组织Fe2+水平 将肝组织研磨匀浆稀释为10%组织匀浆液，根据比色法按照试剂盒说明检测各组小鼠肝组织Fe2+水平。

3.6 免疫组化检测肝脏FTH1、IREB2 和GPX4 蛋白表达 将石蜡切片按照常规操作，进行脱蜡、微波炉修复、封闭后，分别加入 GPX4、IREB2 和 FTH1 Ⅰ抗孵育过夜、Ⅱ抗孵育、显色、苏木素复染、1%盐酸乙醇分化、水洗返蓝、脱水透明，中性树脂封片后光镜下观察。

3.7 各组小鼠肝组织SOD 活性及MDA 和GSH 含量的检测 取0.1 g 的小鼠肝组织研磨成匀浆液，用预冷的PBS 将其稀释为10%肝脏组织匀浆液待用。4 ℃、10 000×g离心10 min 取上清置于冰上待测。按照试剂盒说明书测定SOD 活性及MDA 和GSH水平。

3.8 Western blot 法检测肝脏组织 GPX4、IREB2 和FTH1 蛋白表达 随机数表法选取各组小鼠3 只，取其肝脏组织中加入RIPA 蛋白裂解液，研磨棒充分研磨后置于冰上30 min，4 ℃、13 684×g离心10 min，取上清测定蛋白浓度。取适量蛋白加入SDS-PAGE 上样缓冲液混匀，100 ℃变性5 min。按照60 μg上样量算出各组样本上样体积进行电泳并恒压湿转至PVDF 膜，5%脱脂奶粉封闭1 h。孵育Ⅰ抗过夜，TBST 洗膜3 次后，加入对应Ⅱ抗，孵育1 h；重复洗膜步骤，ECL 化学发光显色，分析灰度值，用目的蛋白与内参蛋白比值作为目的蛋白表达水平。

3.9 RT-qPCR 法检测肝组织 GPX4、IREB2 和 FTH1的mRNA 表达水平 称取小鼠肝脏组织30 mg，Trizol 法提取组织RNA，具体步骤按照试剂盒说明书操作，用核酸/蛋白定量仪来检测RNA 的浓度和A260/A280值，以判断RNA 提取纯度。利用Prime-Script®RT Enzyme Mix 试 剂 盒 将 RNA 逆 转 录 成cDNA，加入扩增反应体系运用实时荧光定量PCR法扩增，40 个循环反应结束后用2-ΔΔCt法进行相对定量分析，检测基因mRNA 相对表达水平。以GAPDH为内参照，引物由生工生物工程股份有限公司合成，序列见表1。

表1 RT-qPCR引物的序列Table 1. The sequences of the primers for RT-qPCR

3.10 ELISA 法检测小鼠肝脏 TNF-α 和 IL-6 表达水平 将肝组织和PBS 按1∶9 的比例进行研磨匀浆稀释为10%组织匀浆液，根据ELISA 试剂盒说明书，检测各小鼠肝脏TNF-α和IL-6水平。

4 统计学处理

采用GraphPad Prism 8.0 软件进行统计分析。计量数据均以（mean±SD）表示。多组间比较用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 各组小鼠血脂水平及AST和ALT水平比较

与正常对照组相比，模型组小鼠血清LDL-C、TG、TC、ALT 和 AST 水平显著升高，HDL-C 水平降低（P＜0.05）；与模型组相比，丹蒌片组小鼠血清LDLC、TG、TC、ALT 和 AST 水平显著降低（P＜0.05），HDL-C 水平升高，但差异无统计学意义，见图1A～F。

Figure 1. Effect of Danlou tablets on the serum levels of lipids，AST，ALT and Fe2+ in the mice of each group. A：TG；B：TC；C：HDL-C；D：LDL-C；E：AST；F：ALT；G：Fe2+. Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs model group；#P＜0.05 vs Danlou tablet group.图1 丹蒌片对各组小鼠血脂、AST、ALT及Fe2+水平影响

2 各组小鼠肝脏病理学变化

正常对照组小鼠肝小叶结构正常，细胞核圆且居中，细胞质内未见脂滴，肝索条理清晰且肝窦未见狭窄；模型组肝细胞肿胀变性明显，体积明显增大，细胞质内有大量的脂滴空泡，肝窦狭窄或消失；丹蒌片组脂滴明显减少，肝细胞脂肪变性程度减轻，肝细胞体积部分恢复正常，肝窦狭窄有所减轻，见图2。

3 油红O染色结果

正常对照组小鼠细胞核染为蓝色，肝细胞内未见橘红色脂滴，肝窦结构正常；模型组小鼠肝细胞细胞质内可见弥漫性橘红色脂滴，脂质严重蓄积；与模型组相比，丹蒌片组小鼠肝细胞细胞质内橘红色脂滴明显减少，脂质蓄积程度减轻，见图3。

4 各组小鼠肝组织Fe2+水平

Figure 2. Pathomorphological changes of mouse liver tissues in each group（HE staining，scale bar=50 μm）. The more lipid droplet vacuoles in the cytoplasm，the more obvious swelling and degeneration of hepatocytes. A：control group；B：model group；C：Danlou tablet group.图2 各组小鼠肝组织的病理形态结果

Figure 3. Results of liver lipid deposition in the mice of each group（oil red O staining，scale bar=50 μm）. Blue：nucleus；orange：lipid droplet. More orange lipid droplets mean more serious lipid accumulation. A：control group；B：model group；C：Danlou tablet group.图3 各组小鼠肝脏脂质沉积情况

与正常对照组相比，模型组小鼠肝组织Fe2+水平显著升高；与模型组相比，丹蒌片组小鼠肝组织Fe2+水平显著降低，见图1G。

5 各组小鼠肝组织形态学变化和铁死亡相关蛋白表达的免疫组化检测结果

与正常对照组相比，模型组小鼠肝组织GPX4和FTH1 蛋白表达水平减低，细胞核呈蓝色，细胞质呈棕黄色且颜色较浅，IREB2 蛋白表达水平升高，棕黄色较深，肝细胞肿胀变性显著，细胞质内有大量脂肪空泡；丹蒌片干预后，GPX4和FTH1蛋白表达水平升高，细胞质呈棕黄色且颜色较深，IREB2 蛋白表达水平减低，棕黄色较浅，肝细胞肿胀变性情况减轻，脂肪空泡数量显著减少，见图4。

6 各组小鼠肝组织GSH、MDA和SOD表达水平

与正常对照组相比，模型组肝组织GSH 和SOD水平显著降低，MDA 水平显著升高（P＜0.05）；在丹蒌片的干预下，肝组织GSH 和SOD 水平显著升高，MDA水平显著降低（P＜0.05），见图5。

7 各组小鼠肝组织中IREB2、GPX4 及FTH1 蛋白表达情况

与正常对照组相比，模型组小鼠肝组织GPX4和FTH1 蛋白表达水平呈现下降趋势，但IREB2 蛋白表达水平呈现上升趋势（P＜0.05）；丹蒌片干预后GPX4和FTH1 蛋白表达水平显著升高，IREB2 蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），见图6。

8 各组小鼠肝组织相关mRNA的表达水平

与正常对照组相比，模型组小鼠肝组织GPX4和FTH1 的 mRNA 表达水平显著降低，IREB2 的 mRNA表达水平显著升高（P＜0.05）；丹蒌片干预后GPX4和 FTH1 的 mRNA 表 达 水 平显著升高，IREB2 的mRNA表达水平显著减低（P＜0.05），见图7。

9 各组小鼠肝组织TNF-α和IL-6的表达情况

模型组肝组织TNF-α 和IL-6 表达水平与正常对照组相比升高（P＜0.05），丹蒌片干预后TNF-α 和IL-6表达水平减低（P＜0.05），见图8。

讨 论

NAFLD在饮食结构的变化及高强度压力等多重因素作用下，发病率逐年攀升，严重危害人们的健康，故对其防治具有重要意义。而中医学中并无“脂肪肝”这一病名，但依据其临床表现，将其归为“脂浊”“浊阻”“痰湿”“血瘀”等病症范畴。《证治汇补》云；“脾胃受亏，浊气含痰，未能运化即为患。”常食肥甘厚味者，水谷精微运化失常，肝失疏泄，脾失健运，则气机不畅，津液内聚则痰浊内蕴，阻塞于脉，日久积为膏脂。

Figure 4. Morphological changes and ferroptosis-related protein expression in mouse liver tissues in each group（immunohistochemical staining，scale bar=40 μm）. Blue represents the nucleus，while yellow represents the cytoplasm. The darker in the cytoplasm，the higher protein expression.图4 免疫组化检测各组小鼠肝组织形态学变化和铁死亡相关蛋白表达

Figure 5. Effect of Danlou tablets on oxidative stress indexes in each group. A：MDA；B：GSH；C：SOD. Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs model group；#P＜0.05 vs Danlou tablet group.图5 丹蒌片对各组小鼠氧化应激指标水平的影响

丹蒌片方中的薤白和瓜蒌，宽胸散结，化瘀通阳，为君药，取自张仲景的《金匮要略》治疗胸痹心痛之名方“瓜蒌薤白白酒汤”；赤芍、丹参、川芎和葛根，活血化瘀通络，为臣药；泽泻和黄芪，利水渗湿，补气健脾行血，为佐药；骨碎补，活血补肾，郁金、川芎和丹参专入心肝二经，皆有引经报使之功效。如此君臣佐使相辅相成，集宣痹、化痰、化瘀、通滞、理气、养血于一体，从而达到治疗NAFLD的目的。

细胞铁死亡及其引起的肝细胞氧化损伤是NAFLD 发病的重要环节［17］。而 Fe2+作为诱发细胞铁死亡和NAFLD 发生发展的主要致病因素，可导致肝脏氧化应激和炎症反应［18-19］，而本研究利用鉴定细胞铁死亡发生的常用指标 GPX4［20］，初步证实了 Fe2+可显著诱导肝细胞铁死亡。本研究通过观察NAFLD模型小鼠的Fe2+水平，同样观察到NAFLD 模型小鼠中Fe2+的升高可引起细胞铁死亡及肝脏氧化损伤，此结果与相关研究报道相一致［21-22］。因此，抑制Fe2+诱导的细胞铁死亡是NAFLD防治的重要策略。

Figure 6. Effects of Danlou tablets on the protein expression of FTH1，GPX4 and IREB2 in each group. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs model group；#P＜0.05 vs model group.图6 丹蒌片对各组小鼠FTH1、GPX4和IREB2蛋白表达的影响

Figure 7. Effect of Danlou tablets on the mRNA levels of indicators of ferroptosis，FTH1（A），GPX4（B）and IREB2（C），in each group. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs model group；#P＜0.05 vs Danlou tablet group.图7 丹蒌片对各组小鼠铁死亡指标FTH1、GPX4和IREB2 mRNA水平影响

细胞铁死亡发生的关键分子机制是Fe2+水平的升高促进IREB2 蛋白泛素降解，与铁调节蛋白亲和力减弱，抑制FTH1 的表达，引起细胞铁死亡并向胞外释放出 IL-6 和 TNF-α 等炎症介质及 MDA 等氧化应激因子而引发更为严重的氧化损伤反应［23-25］。目前体内和体外实验研究已充分表明高脂饮食和其他NAFLD 发病危险因素如Fe2+均可通过调控铁死亡因子引起细胞铁死亡而引发肝脏氧化损伤及NAFLD的发生发展［17，20-21］。在本研究中，我们也观察到Fe2+可通过上调IREB2，下调FTH1 和GPX4 的表达促使IL-6、TNF-α 和 MDA 水平升高，SOD 及 GSH 水平降低。因此，本研究结果进一步表明铁死亡通路的激活可能引起炎症反应和氧化应激反应，进而参与了NAFLD 的进程，并且Fe2+诱导的肝细胞铁死亡对于探讨NAFLD的关键机制具有重要意义。

Figure 8. Effects of Danlou tablets on inflammatory indexes in each group. Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 model group.图8 丹蒌片对各组小鼠炎症指标影响

丹蒌片作为一种复方片剂，可通过调节不同生物学过程发挥抗脂、抗炎、抗动脉粥样硬化等作用［8，11］，然而丹蒌片是否可调控细胞铁死亡介导的NAFLD 的发生发展尚未完全清楚。在本研究中，我们利用丹蒌片深入研究了其对Fe2+诱导的细胞铁死亡和铁死亡标志蛋白表达的影响。结果显示丹蒌片可通过下调IREB2，上调FTH1 和GPX4 蛋白及mRNA 的表达而抑制Fe2+诱导的细胞铁死亡。虽然已有研究表明可通过调控铁死亡通路标志蛋白（FTH1、GPX4 或胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白）的表达而发挥治疗 NAFLD 作用［17，21，26］，但以上研究因缺乏细胞铁死亡关键指标（铁代谢蛋白IREB2）的检测而未能充分阐明对细胞铁死亡的调控作用。而本研究结果不仅显示出丹蒌片对Fe2+诱导的细胞铁死亡有抑制作用，且还通过对细胞铁死亡指标FTH1、GPX4 及IREB2 蛋白与mRNA 的表达检测进一步阐明了丹蒌片可通过铁死亡途径调控NAFLD 模型小鼠肝脏氧化损伤的机制。

综上所述，丹蒌片对NAFLD 模型小鼠的防治可能是通过抑制肝细胞铁死亡，降低肝脏氧化应激水平和炎症因子水平来实现的。