FOXM1688-748 结构域相互作用蛋白的鉴定

谭拥军，杨仕平，余雳，黄小芹，陈燕，谭桂湘

（湖南大学 生物学院，湖南 长沙 410082）

FOXM1（Forkhead box M1）是转录因子FOX 家族的成员，该家族成员都有一个保守的翼状螺旋DNA 结合结构域[1].FOXM1 几乎在所有肿瘤细胞中高表达，是基因表达和细胞循环机制以及其他重要生理过程的关键调节器[2]，参与肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭、转移、上皮-间质转化、肿瘤血管生成、防止细胞过早衰老等过程[3-7]，它与癌症的发生和发展存在着至关重要的关系，已被确立用于癌症诊断、治疗和预后[8].FOXM1 蛋白主要包含3 个结构域，分别是保守的DNA 结合结构域（DBD）、N-端抑制结构域（NRD）、C-端转录激活结构域（TAD）[9].FOXM1 激活靶基因转录的机制中，通过直接结合靶基因启动子后招募其他共激活因子，激活基础转录机器，从而启动转录[10].通常情况下，FOXM1 的N-端抑制结构域与C-端转录激活结构域相互作用，抑制FOXM1 的转录活性[11-12].FOXM1 需要发挥转录激活作用时，主要依赖细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）和PLK1 激酶，对FOXM1 的TAD 进行磷酸化，使TAD 构象发生变化，诱导NRD 释放TAD.随后磷酸化的TAD 可募集共激活剂CBP，实现激活基因转录[13].

目前，已发现FOXM1 与许多蛋白发生相互作用.一些互作蛋白作为FOXM1 的正调节因子，通过激活FOXM1 的功能，增强其在癌细胞中的活性，如NPM、MELK、Pin1 等蛋白[14].另一些互作蛋白可作为FOXM1 的负调节因子，通过抑制FOXM1 的功能来减弱其在癌细胞中的活性.如在蛋白毒性应激下，HSP70 与FOXM1 的相互作用抑制了FOXM1 的DNA 结合能力[15].此外，FOXM1 与其他蛋白相互作用，发挥介导这些蛋白激活或增强其致癌通路的功能.如在胶质瘤细胞中，FOXM1 直接结合β-catenin，增强了β-catenin 的核定位和转录活性，从而激活WNT 信号通路[16].

近几十年来，对FOXM1 的转录激活研究较多集中在其转录激活结构域的氨基酸修饰上，而对直接调控转录激活结构域的研究较少.为了拓展FOXM1 转录激活结构域对其转录活性影响的认识，本文通过体外纯化该结构域的方法，来研究其他可能通过TAD 结构域调控FOXM1 转录活性的机制，这对揭示FOXM1 蛋白的分子功能具有重要的生物学意义.

1 材料与方法

1.1 材 料

质粒pGEX-4T2、FOXM1 CDS 序列由本实验室保存；乳腺癌细胞MDA-MB-231 购自美国模式培养物保藏所（American Type Culture Collection，ATCC）；胎牛血清（FBS）购自GIBCO 公司；感受态细胞DH5α、BL21 Rosetta（DE3）、DNA 聚合酶、PCR 引物、1 kb DNA maker 购自北京擎科生物技术有限公司；T4 DNA 连接酶购自Ferments 公司；限制性内切酶XhoI、BamH1 购自Thermo Fisher 公司；Glutathione Sepharose 4B 珠子、GST 抗体、Rabbit 二抗购自碧云天生物技术公司；Mouse 二抗购自Bio-Rad 公司；FOXM1 抗体购自CST（cell signaling technology）公司；BAG2 抗体购自上海生工生物工程股份有限公司.

1.2 方 法

1.2.1 pGEX-4T2-FOXM1688-748载体的构建

在NCBI 中检索FOXM1 的CDS 区序列，截取其第688 位到748 位氨基酸对应的核苷酸序列并结合载体pGEX-4T2 的MCS 位点确定FOXM1688-748的引物.其上游引物为GCGGATCCATGTCCCCG GAGCCACAGGTT，下游引物为GCCTCGAGCTA CTGTAGCTCAGGAAT，划线部分为限制性内切酶BamH1、XhoI 的酶切位点.以FOXM1 的CDS 序列为模板，扩增出FOXM1688-748片段.扩增条件为98 ℃，2 min；98 ℃，10 s；60 ℃，15 s；72 ℃，15 s；35 个循环.将PCR 产物克隆入pGEX-4T2 空载体中，经BamH1、XhoI 双酶切鉴定后送擎科生物有限公司测序.

1.2.2 重组蛋白GST-FOXM1688-748的表达和纯化

将pGEX-4T2-FOXM1688-748、pGEX-4T2 质粒转化入感受态细胞BL21 中，挑选阳性单克隆，加入含有氨苄的LB 培养基中，37 ℃、220 r/min，扩大培养至OD 值为0.6～0.8 的产物，加入终浓度为0.8 mmol/L IPTG，28.5 ℃诱导过夜，4 000 r/min，离心20 min，收集菌体，加入终质量浓度为200～400 mg/mL 溶菌酶冰上裂解30 min.超声破碎，离心收集上清，加入GST 珠子，4 ℃孵育2 h.离心弃上清，用PBS 将珠子洗5 遍，GST Elution Buffer 洗脱纯化的蛋白，收集蛋白并用考马斯亮蓝染色检测其纯化效果.

1.2.3 细胞培养

MDA-MB-231 细胞用体积分数为10%的FBS和1%双抗（100 mg/L 青霉素和链霉素）的DMEM 完全培养基培养，置于37 ℃、体积分数为5%的CO2、相对湿度为90%的细胞培养箱中培养，当MDA-MB-231 细胞密度达到90%后用于Pulldown 实验.

1.2.4 GST-pulldown

收集MDA-MB-231 细胞，加入500 μL 的IP 裂解液，以体积比1 ∶100 的比例加入蛋白酶抑制剂，冰上裂解1 h，12 000 r/min，离心5 min，收集上清.加入30 μL GST 珠子，4 ℃预孵育1 h.1 000 r/min 离心2 min，收集上清，一分为二，分别加入50 μg 原核纯化的GST、GST-FOXM1688-748蛋白、30 μL GST 珠子，4 ℃孵育2 h.1 000 r/min，离心2 min 收集GST 珠子，用预冷的PBS 漂洗4 次，加入30 μL 1xLoading Buffer，98 ℃变性15 min 后进行SDS-PAGE 和考马斯亮蓝检测.

1.2.5 质谱分析

将Pulldown 拖下来的蛋白通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）分离后，切下来送上海胡珀生物有限公司打质谱.将实验组与对照组蛋白去重后，选择质谱分数大于2 的蛋白用UniProtKB 在线网站（https：//www.uniprot.org/）分析分子功能，将结果进行整理和归类，得到不同功能的蛋白.为了验证质谱结果的可靠性，挑选潜在的互作蛋白BAG2 进行互作验证，方法同1.2.3 节中的方法.

2 结果与分析

2.1 pGEX-4T2-FOXM1688-748 载体的构建

以FOXM1 CDS 序列为模板，扩增出FOXM1688-748目的条带，其大小为200 bp 左右（图1（a））.将该片段克隆入经酶切后的pGEX-4T2 载体中，进行菌落PCR 和双酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳显示其在100～300 bp 有明显的条带（图1（b）（c）），pGEX-4T2-FOXM1688-748载体示意图如图1（d）所示.将构建好的载体进行序列比对，结果显示与本文设计结果相同（图1（e））.由此可知，本文成功构建了pGEX-4T2-FOXM1688-748原核表达载体.

图1 pGEX-4T2-FOXM1688-748 质粒的构建及鉴定Fig.1 Construction and identification of pGEX-4T2-FOXM1688-748 plasmid

2.2 重组蛋白GST-FOXM1688-748 的表达与纯化

将克隆成功的pGEX-4T2-FOXM1688-748质粒转化入大肠杆菌感受态细胞BL21 Rosetta，挑选阳性单克隆扩大培养，用GST 珠子纯化，考马斯亮蓝染色展示纯化结果如图2 所示.由图2 可知，GST 和GSTFOXM1688-748蛋白的纯化效果较好，并且可以得到较高浓度的GST、GST-FOXM1688-748蛋白，为后续的Pulldown 实验提供实验材料.

图2 重组蛋白GST 和GST-FOXM1688-748 考马斯亮蓝染色Fig.2 Coomassie blue staining of GST and GST-FOXM1688-748 proteins

2.3 FOXM1688-748 与FOXM1 全长蛋白相互作用

为了验证FOXM1688-748与FOXM1 全长蛋白的作用关系，通过GST-pulldown 的方法来验证它们的相互作用.用预清除的MDA-MB-231 细胞裂解液分别与GST、GST-FOXM1688-748重组蛋白孵育，用FOXM1、GST 抗体进行免疫印记检测.重组蛋白GSTFOXM1688-748可以拖下其全长蛋白FOXM1，而GST蛋白在同一位置未检测到FOXM1 条带，表明FOXM1688-748可以与其全长相互作用（图3），证实了纯化的重组蛋白FOXM1688-748具有良好的生物活性.

图3 Pulldown 结果及Western blot 分析Fig.3 Pulldown result and Western blot analysis

2.4 FOXM1688-748 互作蛋白的鉴定

为了研究FOXM1688-748可能的生物学作用，将GST-pulldown 拖下来的蛋白送公司进行质谱鉴定，取质谱分数大于2 的蛋白进行分析，得到112 个蛋白，其中有2 个蛋白已被证明与FOXM1 的转录激活结构域互作，分别是CDK1 和FOXM1.对质谱中的蛋白进行分类和整理，发现这些蛋白分子功能较多集中于蛋白质的加工和分泌、细胞周期和分裂、翻译过程（图4）.在蛋白质的加工和分泌方面，捕获到的蛋白有HSP90AB1、HSPB1、BAG2、USP9Y、DERL1、UBB、FAM129A 等，其中HSP90AB1、HSPB1、BAG2与蛋白质的折叠有关，USP9Y、DERL1、UBB 与蛋白质的泛素化有关，FAM129A 参与翻译后蛋白质的磷酸化.在细胞周期和分裂方面，捕获到的蛋白有CDK1、FOXM1、MCM7、RPN2、MISP、NCAPG 等，这些蛋白在细胞分裂过程中发挥了重要的作用.在翻译方面，捕获到的蛋白有GCN1、RACK1、LARS、DDX39A、HNRNPA0 等，GCN1、RACK1、LARS 参与蛋白质的合成过程，而DDX39A、HNRNPA0 分别参与mRNA 的前期剪接和细胞因子mRNA 的转录后调控.

图4 互作蛋白的功能分析Fig.4 Functional analysis of interacting proteins

2.5 FOXM1688-748 与BAG2 的互作验证

为了验证质谱结果的可靠性，从质谱中挑选潜在的互作蛋白BAG2 进行互作验证.在Pulldown 实验结果中，原核表达的FOXM1688-748可与MDA-MB-231 细胞中内源的BAG2 相互作用（图5）.上述结果证实了质谱结果的可靠性，并为研究FOXM1 C 端互作蛋白的功能及分子机制提供实验依据.

图5 FOXM1688-748 与BAG2 互作Fig.5 FOXM1688-748 interacts with BAG2

3 讨论

Pulldown 是一种广泛用于体外检测两种或多种蛋白质之间的物理相互作用的方法，以确认预测的蛋白质-蛋白质之间的相互作用或捕获新的互作蛋白[17].在这项研究中，本文成功纯化了FOXM1 转录激活结构域FOXM1688-748，并利用Pulldown 实验证实它能够与FOXM1 全长蛋白互作，这是由于FOXM1的NRD 可以与其TAD 相互作用[11].由于内源FOXM1的TAD 需要在细胞周期蛋白依赖性激酶的磷酸化后才能被NRD 释放，为了直接获得与FOXM1 转录激活结构域相互作用的蛋白，利用GST-pulldown 方法，在不受NRD 影响的情况下，通过质谱鉴定得到一系列与其相互作用的蛋白.FOXM1 在肿瘤的发生发展中具有至关重要的作用，这离不开各种互作蛋白对FOXM1 的翻译后调控.在质谱结果中，我们捕获到一些已知的FOXM1 互作蛋白，如CDK1.在细胞分裂的S 期或M 期，CyclinB1/CDK1 复合物结合FOXM1 的转录激活结构域，诱导CDK1 磷酸化FOXM1，磷酸化后的FOXM1 招募共激活因子CBP，从而激活FOXM1 的转录活性[10].根据质谱结果中蛋白质的功能，预示RPN2、MISP、MCM7、FAM129A 蛋白可能参与调节FOXM1 的转录活性.

除了对FOXM1 翻译后的修饰实现的调控外，一些互作蛋白还可以参与维持FOXM1 蛋白的稳定性，它们通过对FOXM1 的去泛素化作用来增强FOXM1的稳定性，如USP21.在基底样乳腺癌细胞中，USP21与FOXM1 互作，使FOXM1 去泛素化免受蛋白酶体的降解[18].质谱结果中也存在一些泛素化分子，如USP9Y、CUL4A，预示这些蛋白参与FOXM1 蛋白的泛素化或去泛素化，从而调节其蛋白质的稳定性.此外，一些与蛋白质折叠有关的分子伴侣也出现在质谱结果中，如HSPB1、USP9Y、BAG2.Pulldown 实验也证实BAG2 与FOXM1 的互作，预示这些蛋白可能通过对FOXM1 蛋白的折叠来维持其稳定性.

FOXM1 作为经典的转录因子，其主要的功能是结合到下游靶基因的启动子上，招募一些转录复合体，实现对靶基因的转录激活[19].质谱中也出现了一些与转录相关的蛋白，如RuvBL1.RuvBL1 是NuA4组蛋白乙酰转移酶复合物的成分，主要通过对核小体组蛋白H4 和H2A 的乙酰化参与靶基因的转录激活，这种修饰既可以改变核小体与DNA 的相互作用，又可以促进修饰的组蛋白与其他可正向调节转录的蛋白质的相互作用[20].预示RuvBL1 可能被招募到转录复合体中，参与FOXM1 对下游靶基因的激活.

综上所述，利用FOXM1688-748重组蛋白为原料，通过Pulldown 结合质谱的方法获得了FOXM1 转录激活结构域的潜在互作蛋白，并对这些潜在互作蛋白的分子功能进行分析归类.这为后续研究FOXM1转录激活结构域的互作蛋白提供可靠的实验依据，对探究FOXM1 分子的生物学功能具有重要的意义.