菊花-麦冬治疗干眼的网络药理学研究

张文晶，颉瑞萍，张花治，王永涛，于华楠，袁晓彤，张子怡

干眼又称角膜干燥症，是常见的眼表疾病.其主要的病理机制是指泪液的量或质以及流体动力学异常造成泪膜稳定性降低、眼表损害，导致角膜和结膜上皮的正常功能遭到破坏[1]。以眼部干涩、疼痛、发痒、畏光及异物感为主要临床表现，并伴随视疲劳、视物模糊等症状，严重者会导致角结膜干燥、炎症、溃疡一系列病变，严重影响患者的日常生活和工作质量。近年来，随着科技水平的不断提升，电脑、手机等智能设备的普及，长时间面对电子屏幕、用眼不当使干眼的发病率逐年上升且呈现出年轻化趋势。流行病学研究[2]显示，我国干眼的发病率为21%～30%，患病率约为6.1%～52.4%。中医药在干眼的治疗中基于整体观念，辨证施治、据法选方、合理配伍，具有疗效确切、安全性高、价格低廉的特色优势，在临床上受到了广大患者的认可，但其具体的分子学机制尚不明确。随着生物信息学的发展，网络药理学作为一门新起的学科，可通过软件操作技术构建出“药物-疾病-靶标-通路”网络，进而深入分析药物治疗疾病相关的基因蛋白、信号通路，揭示中药及复方对机体整体调控的本质，为中医药的现代化研究提供全新视角[3]。本研究基于网络药理学探讨菊花-麦冬药对治疗干眼的分子学机制和可能的生物学效应，以期为进一步的基础研究提供方向，为新药的开发构建理论基础，拓宽干眼的中医药防治思路。

1 资料与方法

1.1 菊花-麦冬活性成分筛选及靶点预测

本研究以“Score cutoff≥40，P＜0.05”作为筛选参数，在BATMAN-TCM 中药生物信息数据库输入复方成分中药英文拼音：ju hua 和mai dong，进行菊花、麦冬的入血活性成分及潜在作用靶点检索。

1.2 获取OP 疾病靶点

将“Xerophthalmia”作为关键词输入至OMIM 和GeneCards 在线数据库中，遴选出干眼相关的疾病靶点。

1.3 药对-疾病靶基因交集

整理表格数据后，使用Venny2.1.0 在线工具对获取的菊花-麦冬有效活性成分作用靶点和干眼疾病靶点进行交集靶基因构建，并绘制出Venny 图。使用Cytoscape 3.7.2 软件对获取的共同靶点进行可视化分析，构建“疾病-药对-化合物-靶点”网络，并计算相应的关系节点。

1.4 PPI 网络构建

使用String 软件构建共同靶基因蛋白互作网络，以interaction score≥0.4 为筛选条件，剔除断开连接的节点，得到蛋白的相互作用关系，使用R 软件绘制互作网络邻接节点数目条形图，邻接节点数目越多，说明该基因位于蛋白互作网络的核心，对整个网络起的作用最关键。

1.5 GO 功能富集分析

使用clusterProfiler R 软件包对共同靶基因进行GO 功能富集分析（P value Cutoff＜0.05,Q value Cutoff＜0.05），预测菊花-麦冬治疗干眼核心基因参与调控的生物学过程。

1.6 共同靶基因KEGG 功能富集分析

对复方-疾病的交集靶基因通过clusterProfiler R 软件（P value Cutoff＜0.05,Q value Cutoff＜0.05），进行计算，获取与治疗干眼相关的信号通路。

2 结果

2.1 菊花-麦冬活性成分筛选及靶点预测结果

在BATMAN-TCM 中药生物信息数据库上检索到菊花-麦冬入血活性成分46 个，预测靶点291 个（表1）。

表1 菊花-麦冬有效活性成分

2.2 疾病靶点获取结果

在OMIM 和GeneCards 遗传基因数据库中输入“Xerophthalmia”进行检索，筛选出干眼相关的疾病靶点9661 个。

2.3 共同靶基因交集结果

将筛选出的291 个菊花-麦冬作用靶点与疾病有关的9661 个靶标整理后使用VennDiagram.R 软件包进行数据分析，获取共同靶基因173 个，并构建交集靶基因Venny 图（图1）。将获得的173 个共同靶基因与菊花-麦冬的46 个有效活性成分使用Cytoscape 3.7.2 软件进行可视化处理，构建出“疾病-药对-化合物-靶标”调控网络，共整理出927 对关系数据和221 个关联节点。图中红色六边代表干眼症，蓝色四边形代表中药药对，黄色三角形代表化合物，绿色圆形代表靶点，数据结果表明，菊花-麦冬可能主要通过这43 个化合物作用于共同靶基因而对干眼症产生相应的影响（图2）。

图1 “菊花-麦冬”与 干眼症共同靶基因Venny 图

图2 干眼-药对-化合物-靶标调控网络

2.4 PPI 网络构建结果

使用String 软件交集靶点构建蛋白互作网络，得到171 个靶蛋白的相互作用关系（图3）。将所得数据输入R 语言软件绘制蛋白互作网络邻接节点数目条形图，结果表明，CAT、TNF、CREB1、ESR1、COMT、ADK、NT5C2、NT5E、AR、PTGS2、NR3C1、ADCY1、DCK、F2、OAT、ADA、ENPP1、DNMT1、PPIG、TYMS、ATM、LRAT、CYP19A1、DRD2、AMPD3、IMPDH1、OTC、RBP1、ADH1A 的邻接数目分别为33、28、27、25、23、22、22、22、21、21、20、19、19、19、19、18、18、17、17、17、16、16、15、15、14、14、14、14、13，由图4可以看出CAT、TNF、CREB1、ESR1、COMT、ADK、NT5C2、NT5E、AR、PTGS2 的网络邻接节点数目均大于20，位于网络最核心。

图3 蛋白相互作用网络图

图4 蛋白相互作用网络互作网络邻接节点数目条形图

2.5 GO 功能富集分析结果

利用clusterProfiler R 包对173 个共同靶点基因进行GO 富集分析，涉及功能156 个，包括辅因子结合、维生素结合、氧化还原酶活性，3′，5′-环核苷酸磷酸二酯酶活性、环核苷酸磷酸二酯酶活性、辅酶结合、类固醇结合、羧酸结合、有机酸结合、3′，5′-环-GMP 磷酸二酯酶活性、醇脱氢酶（NADP+）活性、离子门控通道活性、离子通道活性、醛酮还原酶（NADP）活性、门控通道活动、视黄醇脱氢酶活性、底物特异性通道活性、电子转移活性、磷酸二酯水解酶活性等（图5、6）。

图5 GO 富集top20 结果柱状图

2.6 KEGG 通路富集分析结果

使用clusterProfiler R 包对173 个共同靶点基因进行KEGG 功能富集分析，结果显示菊花-麦冬治疗干眼涉及的信号通路有64 条，包括嘌呤代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、视黄醇代谢、嘧啶代谢、吗啡成瘾、皮质醇合成与分泌、非酒精性脂肪肝病（NAFLD）、酪氨酸代谢、甲状腺激素合成、TRP 通道炎性介质调节、长寿调节途径、脂肪酸降解、胰高血糖素、雌激素、糖酵解/糖异生、血清素能突触、cGMP-PKG、氨基酸生物合成、DNA 复制等信号通路，（图7、8）。

图6 GO 富集结果top20 气泡图

图7 富集结果top20 柱状图

结果显示，菊花-麦冬可能主要通过视黄醇代谢信号通路、嘌呤代谢信号通路、精氨酸和脯氨酸代谢信号通路、嘧啶代谢信号通路、吗啡成瘾信号通路、皮质醇合成与分泌信号通路、非酒精性脂肪肝病（NAFLD）信号通路、酪氨酸代谢信号通路、甲状腺激素合成信号通路、TRP 通道炎性介质调节信号通路而发挥治疗干眼症的作用。

3 讨论

图8 KEGG 富集top20 点图

根据古典医籍记载，干眼属于中医学“白涩症”“燥证”“枯症”等范畴[4]。《审视瑶函·内外二障》[5]曰：“眼乃五脏六腑之精华，上注于目”，可见视觉功能的正常发挥依赖于脏腑精气的濡润滋养。若气血亏虚、津液损耗、阴精亏损不能上荣于目，则见眼部干涩、烧灼、疼痛或视物模糊，如《素问玄机原病式·六气主病》[6]所言：“诸涩枯涸，干劲揭皴，皆属于燥”，故养阴润燥是中医治疗干眼的基本原则[7]。菊花-麦冬是临床最常使用药对，菊花性寒入肝经以疏风散热、明目清肝；麦冬味甘性微寒能滋阴润肺，益胃生津，二者配伍以养阴润目为本，兼清虚火，以收标本同治之效。智亚伟等人[8]对国内治疗干眼27 个经验方进行了分析，涉及中药78 味，使用频率最多的药物依次是菊花、枸杞子、生地、麦冬。文瑾等人[9]基于数据挖掘对75 首方剂、164 味中药进行了分析，发现频次较高的药物有甘草、枸杞子、熟地黄、麦冬、菊花。白雪等[10]人运用统计学方法对近10 年文献数据库中收录的149 首方子进行了用药规律的分析，发现使用频数较高的药物排序依次是菊花、麦冬、枸杞子。数据挖掘的研究结果表明具有滋阴润燥、养血明目作用的中药是治疗干眼的首选，菊花和麦冬也是最常选用的药对，但是中药活性成分多样，作用机制复杂，传统单一的研究方法不能充分阐释中药及复方治疗干眼症的分子学途径。

本研究基于网络药理学，对菊花-麦冬治疗干眼的作用机制进行了分子学角度的阐释。在BATMAN-TCM 数据库中筛选到“菊花-麦冬”的入血活性成分有46 个，包括麦冬素A、菊花三醇、石竹烯、水苏碱、鸟苷、乙酸龙脑等。其中水苏碱在降低血管阻力、改善血液流速方面的作用已经明确，刘保松等人[11]研究证实水苏碱能够减轻小鼠局灶性脑缺血再灌注损伤，其作用机制与改善脑部微循环、抑制细胞凋亡密切相关。吴晓松等人[12]研究发现，乙酸龙脑酯从一定程度上可以提高小鼠的疼痛耐受能力，具有明显的抗炎镇痛作用。菊花-麦冬治疗干眼涉及的核心基因包括有CAT、TNF、CREB1、ESR1、COMT、ADK、NT5C2、NT5E、AR、PTGS2，以上基因靶点可能通过对机体部分酶、离子通道、底物特异性通道、电子转移等活性的影响，以及调节因子、维生素、辅酶、类固醇、羧酸、有机酸等的结合而发挥生物学效应。KEGG 结果表明“菊花-麦冬”药对治疗干眼涉及的信号通路有64 条，主要包括视黄醇代谢信号通路、嘌呤代谢信号通路、精氨酸和脯氨酸代谢信号通路、嘧啶代谢信号通路、吗啡成瘾信号通路、皮质醇合成与分泌信号通路、非酒精性脂肪肝病（NAFLD）信号通路、酪氨酸代谢信号通路、甲状腺激素合成信号通路、TRP 通道炎性介质调节信号通路。目前在干眼相关信号通路方面的研究较少，主要是是围绕MAPK信号通路、TLR4 通路、TLR2/NF-κB 炎症通路展开。杨青霞等人[13]研究发现，抗抑郁药氟西汀导致干眼的病理机制与激活TLR2/NF-κB 信号通路，导致炎性因子呈高表达水平有关。MAPK 信号通路在干眼的发生过程中有着重要作用，肖位保[14]对二者之间的关系进行了总结，MAPK 信号通路主要通过对机体炎性水平的调控而影响干眼的发病，因此阻断MAPK 信号通路可以改善患者临床症状。

综上所述，菊花-麦冬药对治疗干眼具有多系统、多靶点、多途径的调控作用，借助网络药理学对其具体的分子学机制进行了揭示，科学阐释了中医学整体观念与辨证论治的诊疗特点。但是KEGG 富集分析显示的众多信号通路目前还未研究，这也是今后进一步科研的方向与突破口。