二甲双胍联合维生素E对大鼠非酒精性脂肪性肝病防治作用的研究

刘雯卿，陶浩，刘传，毛一凡，石玮

(皖南医学院公共卫生学院，安徽 芜湖 241002)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除大量饮酒与其他因素以外[1]，以弥漫性肝细胞脂肪变性和脂质沉积为主要的病理变化，导致终末期肝脏病变合并心血管和代谢疾病的最常见的临床病理综合征[2]。NAFLD可以继续进展为非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化和肝细胞癌[3]。据报道，非酒精性脂肪性肝病在大多数西方国家人群中的患病率约达30%，国内患病率也与之类似[4]，而且患病人群越来越趋于年轻化，这将给个人和社会带来极大的负担。同时，NAFLD的持续存在以及严重程度也被证明是心血管疾病的独立危险因素[5]。目前，NAFLD的发病机制尚未明确，暂无理想有效的治疗药物，且单一的治疗方式不佳。

NAFLD的治疗目的在于降低胰岛素抵抗水平以及氧化应激水平，而二甲双胍和维生素E作为副作用较小，效果较明显的胰岛素增敏剂与抗氧化剂，在众多的试验和临床中都有应用[6]。本研究基于二甲双胍和维生素E不同的药理效应，通过不同靶点联合给药，来探讨二甲双胍(MET)和维生素E(VE)联合给药的协同作用关系，以期为NAFLD的基础研究和临床治疗提供相关参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

50只8周龄清洁型Wistar雌性大鼠，由皖南医学院机能实验中心提供，体质量(200±20)g，实验全程大鼠的处置完全遵守本校实验动物伦理委员会的准则。

1.2 实验材料

普通饲料购自长沙市天勤生物技术有限公司；高脂乳剂由本实验组自行配制；分析天平(FA1104)购自上海光正医疗器械有限公司；胆固醇(批号：20200513)、甘油三酯(批号：20200426)、低密度胆固醇(批号：20200516)、高密度胆固醇(批号：20200423)、超氧化物歧化酶(批号：20200323)及丙二醛(批号：20200516)试剂盒购自南京建成生物工程研究所；微量移液器购自德国艾本德股份公司；酶标板快速孵育器(Thermo Fisher Scientific Oy，Multiskan GO 1510)；高速低温离心机(X-30R)购自美国Beckman-Coulter公司。

1.3 实验方法

1.3.1 NAFLD大鼠模型建立与处理

50只Wistar雌性大鼠，标准饮水饮食，实验前适应性喂养10 d左右，将其随机分为5组，每组各10只，分别标记为对照组﹑高脂组﹑二甲双胍治疗组(MET组)、维生素E治疗组(VE组)和二甲双胍联合维生素E治疗组(联合组)。5组大鼠全部采用基础饲料足量喂养，除对照组以外，其余4组大鼠均采用自制的高脂乳剂(配方：复合维生素1.25 g+食用盐(氯化钠)、胆酸钠、胆固醇各5 g+丙二醇15.55 g+吐温80 18.2 g+奶粉40 g+白砂糖(蔗糖)75 g+蒸馏水150 g+玉米油200 g)灌胃，剂量为2 mL/(100 g·d)，每日1次。MET组灌含有二甲双胍量为250 mg/(kg·d)，VE组灌含有250 mg/(kg·d)，联合组灌含有二甲双胍联合维生素E制剂量均为250 mg/(kg·d)。每两周称量1次大鼠体重，记录数据变化。

1.3.2 肝体脂数

第10周末，用3%戊巴比妥钠将大鼠麻醉后，取肝脏称重，并计算肝指数(%)= 肝重/大鼠体重 ×100%。

1.3.3 血清学指标

血脂四联(TC、TG、HDL-C、LDL-C)检测方法分别如下：大鼠第10周饲养结束时集中处死后提取血清，直接法测量大鼠血清中高密度脂蛋白和低密度脂蛋白，而甘油三酯和总胆固醇的检测方法分别采用COD-PAP和CPO-PAP法。4项生化指标全部按照试剂盒中的说明书进行检测。

1.3.4 抗氧化应激指标

超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)。测定方法分别如下：大鼠第10周饲养结束时集中处死后提取血清，采用直接法测量大鼠血清中 SOD和MDA。两项指标均根据试剂盒说明书步骤加样，在酶标板快速孵育器上读取检测指标的吸光度，分别计算两者的含量。

1.3.5 大鼠肝脏样品采集

第10周末大鼠集中处死后取肝脏，生理盐水清洗后，将其固定于4%甲醛中用于伊红美蓝染色(HE染色)。

1.4 统计学方法

2 结 果

2.1 大鼠的体重变化情况

第0、2、4、6、10周大鼠体重变化情况。经单因素方差分析显示，不同时间点大鼠体重变化差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 大鼠体重的变化(g)

2.2 大鼠肝指数测量结果

对照组肝指数最低为(2.91±0.24)%，联合组肝指数最高为(3.69±0.32)%，各组间肝指数差异具有统计学意义(F=15.46，P<0.001)。对照组与其他4组大鼠肝指数变化差异均有统计学意义(P<0.001)；MET组和联合治疗组大鼠肝指数变化差异具有统计学意义(P=0.041)；VE组和MET组肝指数变化以及VE组和联合组肝指数变化差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 大鼠肝指数的变化(%)

2.3 大鼠血脂生化指标检测结果

VE组TG含量最低为(0.67±0.086) mmol/L，高脂组TG含量最高为(0.85±0.11)mmol/L。高脂组LDL-C含量最低为(0.30±0.090)mmol/L，MET组LDL-C含量最高为(0.46±0.14)mmol/L。TC和HDL-C各组间差异无统计学意义(P>0.05)，TG和LDL-C组间差异有统计学意义(P<0.05)。其中TG浓度变化在高脂组、MET组及联合组与VE组之间，差异均有统计学意义(P<0.05)；LDL-C浓度变化在高脂组、联合组及对照组与MET组之间，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 大鼠血脂生化指标的变化(mmol/L)

2.4 大鼠MDA的变化

VE组MDA最低为(0.17±0.09)nmol/mL，对照组MDA最高为(0.28±0.07)nmol/mL。VE组SOD最低为(90.69±4.23) U/mL，MET组SOD最高为(95.92±3.16)U/mL。具体来看：MDA的变化情况具有统计学意义(P=0.005)，联合组和对照组之间差异具有统计学意义(P<0.05)，VE组分别与MET组和对照组之间差异具有统计学意义(P<0.05)；SOD的变化无统计学意义(P>0.05)，见表4。

表4 大鼠MDA和SOD的变化

2.5 大鼠肝脏病理HE染色观察

对照组A大鼠肝细胞结构清晰，索状排列整齐，肝细胞核位于细胞中央，胞质丰富；高脂组B和C大鼠肝细胞索排列明显紊乱，且出现轻度弥漫性脂肪变，肝细胞胞浆内出现数量不一、大小不等的脂滴空泡，将细胞核挤向细胞一侧，见图1。

A：对照组，B和C：高脂组

3 讨 论

通过近年来研究的发现进行总结，“二次打击”是目前最为成熟的解释NAFLD发病机制的学说。由脂质代谢紊乱和胰岛素抵抗所引起的脂质堆积为“一次打击”[7]，“二次打击”是在“一次打击”的基础上，肝脏大量蓄积脂肪并发生氧化应激或过氧化损伤而引起肝细胞炎症、肝纤维化甚至肝硬化[8]。胰岛素增敏剂能够抵抗“一次打击”，而抗氧化剂可以对抗“二次打击”。本实验选取抵抗“一次打击”药物二甲双胍和抵抗“二次打击”药物维生素E联合给药来探究对NAFLD的防治作用，具体讨论情况如下所示。

3.1 大鼠体重及肝指数分析

从大鼠体重的增长情况来看，5组大鼠体重都随着时间慢慢增长，但是各组大鼠体重的变化差异都没有统计学意义(P>0.05)，这与多数高脂饮食喂养模型规律不一致[9-10]，可能是由于本实验采取诱导脂肪肝的方式是通过高脂乳剂进行灌胃，虽然保证了每日的脂肪摄入量，但未能保证总热能的高摄入。并且高脂乳剂的配方对大鼠体重影响也有一定时序性变化[10]642-647。高脂乳剂的灌胃很可能影响了大鼠对饲料的食用，因此本实验最终未能使实验组的体重高于对照组。

虽然体重增长强度在不同时期未出现差异，但肝体指数的实验组与对照组存在差异(P<0.05)，提示本实验达到了预期效果。各实验组的肝指数均高于对照组，即大鼠肝脏脂质明显蓄积，很有可能加重了肝脏的脂肪变性，这与汪美汐[11]等研究的非酒精性脂肪性肝病实验模型形成过程基本一致。说明高脂乳剂灌胃虽然在增加大鼠体重方面表现不太理想，但是在诱导脂肪肝的发生上具有一定的促进作用。VE组、MET组以及联合治疗组和高脂组之间肝指数变化无统计学意义(P>0.05)，提示该模型可能具有较长实验周期的特征，故用药治疗组可能并未达到预期疗效。而肝指数在MET组和联合组之间具有统计学意义(P<0.05)，提示单一给药与联合用药之间是有一差异的，但是MET组干预效果明显优于联合组，表明可能是由于VE和MET的剂量配比可能存在一定的缺陷，仍需要通过进一步实验探索最佳的剂量组合。

3.2 大鼠血脂指标分析

从大鼠血清各项生化指标来看，研究发现各组之间TC和HDL-C差异无统计学意义(P>0.05)，而TG和LDL-C差异具有统计学意义(P<0.05)。

有文献[12]表明，TG与LDL-C的异常升高有助于NAFLD的进展。VE组较高脂组的TG含量明显降低，提示维生素E可以有效改善肝脏脂代谢状况，这与马小珺[13]等人的研究一致，此外Sato K等人所作的Meta分析，认为维生素E可以有效改善肝功能，减轻脂肪变性和炎症性损伤，为维生素E在NAFLD防治应用中提供了强有力的证据[14]。TG含量在MET组和联合组与VE组之间差异无统计学意义，暗示用二甲双胍治疗后，肝脏脂代谢无明显改善，说明MET在改善TG方面无优势，这与Said A[15]等经过Meta分析指出的结果以及骆菁怡[6]1319-1324等的研究基本一致。有大量临床随机对照试验及荟萃分析显示，NAFLD患者应用于二甲双胍虽然可以提高胰岛素敏感性，改善体重指数、血清甘油三酯及胆固醇水平，但是并不能有效改善其肝脏组织学情况[15]538-547。

联合组较MET组LDL-C含量明显降低，提示VE和MET在不同靶点之间的作用具有协同关系，即两种药物联合治疗效果要优于MET单独给药治疗，这与陈彩云[16]等研究的联合用药机制所得出的结论基本一致。

3.3 大鼠抗氧化应激指标分析

从大鼠MDA和SOD变化情况来看：SOD主要作用是清除体内自由基，可以和MDA联合反应机体的氧化应激水平。本实验SOD没有差异，可能是由于SOD不稳定，极容易降解，没有及时检测，造成效果不佳，但是P值接近0.05，在重复实验再次进行测量时，可能会得到差异具有统计学意义的结果。需要在下一次的实验中及时检测该指标。同时也有文献提示长期大剂量补充维生素E(≥400 IU/d)可能会诱发促氧化反应[17]，因此也可能是上述原因导致SOD检测各组间无差异。实验表明VE组较MET组以及对照组MDA含量明显降低，说明MDA作为脂质氧化后的终产物，可以有效减轻脂质过氧化程度，保护肝脏，并且VE效果优于MET。而联合组与对照组之间相比较，MDA浓度也大大降低，表明采用MET和VE不同靶点联合给药时，二者不会相互影响，联合作用途径可以推广，这与廖晓辉[18]等人的研究结果基本一致。

临床治疗过程中非酒精性脂肪性肝病尚无明显有效的标准治疗方法，而针对不同靶点的多种药物联合干预方法将是未来研究的方向。本次实验虽然二甲双胍的干预在肝脏脂代谢方面无明显变化，但是维生素E的氧化应激效果显著，同时联合用药具有一定优势。由于这一实验持续时间短，其长期影响、药物剂量-效应关系以及药物剂量配比等方面仍需更深层次的观察和研究。