浅谈复合氨基酸溶液HPLC检测及分析

刘初亮 刘铄佳 刘佳华

广东百试特生物技术研究院有限公司 广东 揭阳 515527

在生命科学研究当中，氨基酸分析是十分关键的一项技术[1]。1958年国外学者先提出了采用离子交换色谱和柱后茚三酮相互结合的方法分析蛋白质水解所形成的氨基酸，提出了早期的氨基酸自动分解技术。在之后的不断发展当中，传统氨基酸分析方法随着高效液相技术、柱载体化学技术等的发展也得到了提升。尤其是在近些年以来，RP-HPLC技术和各种柱前衍生技术相互结合进程的加快，形成了适用性范围更加广泛的氨基酸分析技术。本次研究当中采用HPLC技术检测复合氨基酸溶液中的成分，为后续研究提供参考。大多数的氨基酸不具备荧光发射和吸收特性，采用标准的折射探测仪，在检测氨基酸当中的灵敏度也不够。为了让检测灵敏度得到提升和选择特性分析，通常会把氨基酸衍生化，分为柱前衍生和柱后衍生方法。

1 实验材料及仪器

1.1 样品

所使用到的复合氨基酸溶液样品为广东百试特生物技术研究院有限公司自制，共有三批。

1.2 仪器

高效液相色谱仪为全自动Agilent1200，另外还有超声波清洗器、电子天平等。

1.3 试剂

氨基酸对照品为中国药品生物制品鉴定所提供，其他的化学试剂属于分析纯。

2 方法和结果

2.1 方法

色谱柱为4.6mm×250mm，5µm；流动相为A相为1mol/L乙酸钠水溶液；流动相B相为50%乙腈水溶液。所采用的梯度洗脱模式，流速为1.0ml·min-1，所设定的检测波长为360nm，确定的进样量为20µl，柱温确定为27℃。

2.2 制备样品和对照品

制备对照品时按照样品的处方来进行配置，对照品的计量必须要精密称取，加入适量的水进行超声溶解。选取1ml的量放置到10ml的瓶中，依次加入1ml浓度为0.05mol/L的碳酸氢钠溶液和1ml的1%2-4二硝基氟苯，放入到60℃的水浴中1小时，冷却到室温之后，再使用水进行稀释，达到刻度后，摇晃均匀。在进样之前使用0.45µm的微孔滤膜进行过滤。

制备样品溶液，选择复合氨基酸溶液2ml，分别放置在200ml的量瓶当中，其余的流程和对照品的制备一样。制备空白溶液，按照处方来称取除了氨基酸之外的其他相关组分，按照样品溶液制备的方式完成制备。

2.3 结果

（1）标准曲线的制备。分别在不同的剂量下开展实验分析，对色谱图情况进行记录。峰面积为y，进样量为x，开展线性回归，线性关系良好，相关系数达到0.999。

（2）精密度试验结果

精密吸取对照品溶液，需要20µl的进样量，重复进样5次，对色谱图情况进行记录。最终得到的氨基酸峰面积RSD值在0.1%到1.2%之间，说明方法精密度良好。

试验结果为：L-脯氨酸的RSD为0.1%，L-丝氨酸的RSD为0.2%，L-门冬氨酸为0.2%，L-丙氨酸为0.1%，L-精氨酸为0.1%，L-苯丙氨酸为0.1%，L-丝氨酸为0.2%。

（3）衍生物稳定性试验结果。精密称取适量样品衍生物溶液置于100ml量瓶中，加适量水振摇使其溶解，加水到刻度，摇匀过滤后测定，结果显示RSD值不超过3.4%，样品衍生物溶液室温24h内状态稳定。

（4）重复性试验结果。分别制备5份复合氨基酸溶液，在规定的色谱条件下完成测定。再结合标准曲线法来计算样品当中各种氨基酸的含量，所测量的RSD值也在0.8%到1.8%之间，说明方法的重复性良好。

（5）加样回收试验结果。根据已知含量的复合氨基酸溶液，需要精密选择25ml的剂量。放置到100ml的量瓶当中，按照准备方法得到的2ml的对照品溶液，进样选择为20µL，做好色谱图的记录工作。按照平均峰面积标准曲线法来计算，测量氨基酸的回收率。结果显示回收率在97.0%到100.3%之间，RSD值在2.0%之内。

3 讨论

第一，氨基酸测量当中，衍生化试剂计量的选择必须要合理。所确定的衍生化剂和总氨基酸计量之间的摩尔浓度确定为4∶1，衍生化试剂进样的总浓度应当控制在1mg·ml-1之内，否则可能会导致衍生化出现不完全情况或让基线受到干扰，对最终的分析结果会产生比较不利的影响。

第二，测定L-色氨酸的含量情况。因为色氨酸本身就可以吸收紫外，而且还会和衍生化试剂之间发生反应，出现淬灭导致没有办法吸收。所以在测定色氨酸的过程中，需要使用到直接紫外分光光度测量方法。

第三，需要选择合适的柱温。柱温对于氨基酸最终的分离结果会产生直接的影响，对于组氨酸和苯丙氨酸这些分离难度比较大的成分而言产生的影响更大。

4 结束语

当前国内通常采用定氮法来对氨基酸含量进行测定，专属性比较差，对于产品质量的控制能力十分有限。在复合氨基酸溶液当中采用HPLC的方式进行氨基酸检测整体效果比较好，但是在实际检测当中具体使用哪种检测方法，还是需要结合检测方法的简便程度、衍生速度以及灵敏度和分析结果的速度、重复性以及干扰因素等多个方面考虑，做出更好地选择。