金铁锁种子质量检验方法与分级标准△

熊永兴，曾宇君，苏钛，李云，周国华，杨成金*

1.云南省药物研究所/云南省中药和民族药新药创制企业重点实验室，云南 昆明 650111；

2.云南白药集团中药资源有限公司，云南 昆明 650111；

3.云南白药集团丽江药业有限公司，云南 丽江 674100

种子是中药材生产的源头，种子检验是保证种子质量的重要措施和手段[1]。目前，我国除人参、三七等种子有国家标准外，其他大部分中药材种子的检验规程和质量分级标准还处于空白状态。金铁锁为石竹科植物金铁锁Psammosilene tunicoidesW.C.Wu et C.Y.Wu 的干燥根[2]，始载于明代兰茂所著《滇南本草》[3]，俗称独定子、独丁子、昆明沙参、金丝矮陀等，是中国稀有种和特有单种属植物，为国家二级保护植物。其于1974 年载入《云南省药品标准》，之后进入《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）1977 年版，具有祛风除湿、散瘀止痛、解毒消肿的功效，用于治疗风湿痹痛、胃脘冷痛、跌打损伤、外伤出血等[4-6]，是云南民间治疗风湿、跌打损伤的主要药物之一。随着野生资源的枯竭，金铁锁种植规模得到快速发展，但种源市场秩序混乱，种子质量良莠不齐，种植效果差异较大[7-8]。为此，本研究参照《农作物种子检验规程》及相关文献[9-11]，对金铁锁种子的净度、千粒质量、真实性鉴定、生活力的检验方法及发芽条件进行了系统研究，制定金铁锁种子的检验方法，建立金铁锁种子的质量分级标准，以期为金铁锁的规模化、规范化种植提供参考。

1 材料

金铁锁主要分布在金沙江和雅鲁藏布江沿岸海拔2000～3800 m 的砾石山坡或石灰质岩石缝中，人工种植主要集中在云南西部和西北部，四川省的川西、甘孜、凉山及贵州省毕节地区[12-14]。本课题组对金铁锁的主产区进行实地走访调查，在云南、四川采集样品36 批，经云南省药物研究所邱斌正高级工程师鉴定为石竹科植物金铁锁Psammosilene tunicoidesW.C.Wu et C.Y.Wu 的种子，种子信息见表1。

表1 金铁锁种子信息

KMnO4、NaClO、2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。

MT204T 型分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；D101 型电热鼓风干燥箱（上海实验仪器有限公司）；MGC-450HP 型光照培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）。

2 方法

2.1 扦样

按《农作物种子检验规程》（GB/T 3543.3—1995）中四分法扦样。

2.2 净度分析

金铁锁为总状花序，种子细小，采收时成熟度常不一致，饱满与否难以进行准确鉴定。按《农作物种子检验规程》（GB/T 3543.3—1995）中广义净度分析方法，每批样品重复3次。

2.3 其他植物种子数目测定

按《农作物种子检验规程》（GB/T 3543.3—1995）扦样方法，每批样品重复2次。

2.4 真实性鉴定

采用外观形态观察测量法，从混合样品中随机抽取100 粒净种子逐粒观察种子形态、大小、颜色、表面特征及其他情况，用数显卡尺测量种子的长、宽、厚，记录数据，确定鉴别特征，每批样品重复3次。

2.5 质量测定

采用百粒法、五百粒法和千粒法测定种子质量。百粒法：随机从混合样品中数取100 粒种子，称质量，重复8 次，计算RSD 及变异系数。五百粒法：随机从混合样品中数取500 粒种子，称质量，重复4 次，计算RSD 及变异系数。千粒法：随机从混合样品中数1000 粒种子，称质量，重复2 次，计算重复间差数与平均数之比。

2.6 含水量测定

采用（130±2）℃恒温烘干法和（105±2）℃恒温烘干法，每份试样称取种子样品约4 g，重复3 次。连续称质量，以2次质量之差<0.2%为恒重。

2.7 生活力测定

采用L16（43）正交设计，随机数取净种子100粒，常温条件下用蒸馏水浸泡12 h，去除果皮和种皮，取出胚和子叶放入培养皿中，分别倒入0.15%、0.10%、0.05%、0.01% TTC 溶液，置于25、30、35、40 ℃避光恒温培养箱染色，每1 h观察1次并统计染色情况。每个处理100粒种子，重复3次。

2.8 发芽试验

2.8.1 发芽前处理 取金铁锁种子，分别用纯化水、0.1%、0.2%、0.3% KMnO4和1.0%、2.5%、5.0%NaClO处理10 min，备用。

2.8.2 发芽条件选择 取净种子粒置滤纸和细砂上，分别在15、20、25 ℃恒温培养箱里光照12 h·d-1和黑暗处理，保持培养皿内水分充足，每日查看并记录种子发芽情况，随时挑出腐烂种子并统计。每个处理100 粒种子，4 次重复。

2.9 种子分级标准

采用上述研究确定的检验方法，对收集的36 份金铁锁种子进行净度、真实性、千粒质量、含水量、生活力、发芽率测定。通过对数据进行相关性分析、K-均值聚类分析和标准差分析，制定金铁锁种子质量分级标准。

3 结果与分析

3.1 扦样

金铁锁种子净度分析种子每批最大质量为1000 g，送检样品最少为100 g，净度分析样品最少为10 g。

3.2 净度分析

金铁锁种子平均净度达87%，各组样品种子质量的差值均没有偏离原始质量的5%，检验结果有效。

3.3 其他植物种子数目测定

平均每10 g 金铁锁种子含其他植物种子226.5 粒，平均每千克金铁锁种子含其他植物种子2265 粒，样品其他种子数的组间差距为17，在容许差距范围内，检验结果有效。

3.4 真实性鉴定

金铁锁种子为蒴果棒状，种子狭倒卵形，长约（5.24±0.48）mm、宽约（1.38±0.20）mm、厚约（0.97±0.13）mm，黄绿色。

3.5 质量测定

结果显示，百粒法和五百粒法的变异系数>4%，千粒法的变异系数<4%。因此，金铁锁种子质量测定应采用千粒法。金铁锁种子质量测定结果见表2。

表2 金铁锁种子质量测定结果

3.6 含水量测定

金铁锁种子采用低恒温烘干法时，前4 h迅速失去水分，随后失水缓慢，种子含水量趋于稳定，7 h达到恒重，含水量为10.07%。高温烘干法前2 h 种子迅速失水，随后失水缓慢，种子含水量趋于稳定，4 h 时达到恒重，含水量为10.35%。2 种方法比较，金铁锁种子含水量测定宜选择高恒温烘干法。金铁锁种子含水量测定结果见图1。

图1 金铁锁种子不同测定时间的含水量

3.7 生活力测定

3.7.1 生活力标准的确定 有生活力的金铁锁种子胚轴、子叶被TTC 溶液染为鲜红色或浅红色，染色均匀；无生活力的金铁锁种子胚轴、子叶完全不着色或着浅色，染色不均匀，或局部着色，着色较浅（图2）。

图2 金铁锁种子TTC染色效果

3.7.2 生活力测定影响因素 由表3 可以看出，对金铁锁种子着色的影响因素中，染色时间>染色温度>TTC 质量分数，各温度、TTC 质量分数下，金铁锁种子均表现出染色时间越长染色效果越好；3 h内，温度越高着色率越高，但是随着染色时间的延长，30 ℃时染色率开始升高，且低质量分数TTC表现出优势染色（表3）。因此，选择0.01% TTC溶液、30 ℃下浸种6 h 作为金铁锁种子生活力测定的最佳条件。

表3 不同温度、不同TTC质量分数和不同染色时间对金铁锁种子的染色效果（, n=3）

表3 不同温度、不同TTC质量分数和不同染色时间对金铁锁种子的染色效果（, n=3）

注：同列不同小写字母表示P＜0.05；表4同。

3.8 发芽试验

3.8.1 发芽前处理 发芽前未进行消毒处理的金铁锁种子霉烂率达36.5%，消毒处理后能有效降低种子霉烂率。其中，用2.5% NaClO 消毒处理的种子发芽率最高为89%，种子霉烂率最低为11%。故金铁锁种子发芽前应先用2.5% NaClO 处理，以降低霉烂率。

3.8.2 发芽试验条件确定 金铁锁种子在滤纸和细砂上均能萌发，且在不同温度和光照条件下，滤纸的发芽率和发芽指数较细砂均更高（除20 ℃黑暗条件下的发芽指数），所以滤纸更适合金铁锁种子的萌发；从滤纸各试验组的发芽率和发芽指数来看，除15 ℃黑暗条件下高于光照条件外，其余均表现出光照条件下较高，且可明显看出20 ℃下最高（表4）。因此，20 ℃下，采用滤纸做发芽床，给予光照的发芽率、发芽势和发芽指数最高，该条件最适用于金铁锁种子发芽。

表4 不同温度、不同发芽条件下金铁锁种子发芽率测定结果（,n=3）

表4 不同温度、不同发芽条件下金铁锁种子发芽率测定结果（,n=3）

3.8.3 发芽计数时间确定 金铁锁种子置发芽床后第四天开始逐渐发芽，第七天后发芽速率明显上升，15 d 后发芽率趋于平稳，发芽基本结束。因此，整个发芽计数时间应在第四至十五天，初次计数时间为4 d，末次计数时间为16 d。

3.9 种子质量检验方法

本研究从扦样、净度分析、其他植物种子数目测定、真实性鉴定、质量测定、含水量、生活力、发芽率8个指标对金铁锁种子质量检验方法进行研究，确定适用于金铁锁种子质量指标的检验方法，见表5。

表5 金铁锁种子质量检验方法

3.10 种子质量分级标准制定

3.10.1 种子质量检测结果 根据表5 所示的金铁锁种子质量检验方法，测定从主产区收集的36 份金铁锁种子的发芽率、生活力、含水量、千粒质量、净度、其他种子率6个质量指标，结果见表6。

表6 36份不同来源的金铁锁种子质量指标分析结果

3.10.2 分级指标的确定

3.10.2.1 相关性分析 对36 份金铁锁种子进行相关性分析（Pearson），结果见表7。结果显示，有5 个测量指标均表现出极显著的正相关关系（P<0.01）。种子的生活力、千粒质量和净度对发芽率都有显著的影响，千粒质量和净度间，净度和其他种子率间也存在着较好的相关关系；含水量与各指标间相关性不显著，故不纳入分级指标。故可采用发芽率、生活力、千粒质量、净度和其他种子率5 个指标作为金铁锁种苗质量的分级指标。

表7 36份不同来源的金铁锁种子质量检测标间的相关性分析

3.10.2.2K-均值聚类分析 由于JTS2016QN13 号种子生活力和发芽率明显低于其他组，属于不合格种子，故将其排除分级（后将分为不合格种子级别），剩下的35 组数据针对发芽率、生活力、千粒质量、净度和其他种子率采用K-均值聚类进行分析，将种子质量分为3个等级，结果见表8。

表8 金铁锁种子各指标K-均值聚类分析结果

3.10.3 质量分级标准及评定方法 由于其他种子数是不易控制的变量，差异巨大，不宜将其作为分级的主要参考项目，故以金铁锁种子发芽率、生活力、千粒质量和净度4 项指标的K聚类中心值作为金铁锁种子分级标准的主要参考值，结合生产实践经验和检验的可操作性，最终制定的金铁锁种子质量分级标准见表9。该分级方法采用最低定级原则，即任何一项指标不符合规定标准都不能作为相应等级的合格种子。

表9 金铁锁种子分级标准

4 讨论

近年，金铁锁种子产量大，各地主要采用种子直播的生产方式。种子是金铁锁药材规范化生产的首要条件和基础，优质的种子对稳定和提高金铁锁药材的产量和质量起着极为重要的作用。建立金铁锁种子检验规程和质量分级标准将为金铁锁的规范化生产奠定良好的基础。

在种子分级标准的4 个参考指标中，发芽率、生活力最为重要，可以直接反映种子在田间的用量和出苗率，是实现种子效能的一个重要指标；千粒质量可反映种子成熟度和幼苗的长势等情况。虽然，净度和其他种子数、含水量的高低不是种子生物学特性所决定的，对种子质量的影响较小，但金铁锁为草本植物，且种子颗粒较小，采收加工时极易引入其他种子，易受人为因素和客观因数的影响，播种后不易控制杂草，增加除草的困难，因此在制定金铁锁种子质量标准时应将净度作为一个重要指标进行考虑。此外，发芽率的测定也需要在净度的基础上进行，所以净度对种子质量标准等级的划分具有重要的参考作用。种子含水量与种子发芽率无显著相关性，只与种子的安全贮藏和种子寿命相关，一般情况下在干燥低温条件下贮藏都有利于保持种子的活力。因此，把发芽率、生活力、千粒质量、净度作为金铁锁种子质量分级的重要指标。其他种子数虽然与种子质量存在相关性，但因其受人为影响较大，可以通过后期加工改变，故不作为分级的主要参考项目。