25-羟维生素D3水平与ITP患儿外周血T淋巴细胞相关细胞因子水平的关系

姚 虹，宋贤响

江苏省徐州市儿童医院检验科，江苏徐州 221006

特发性血小板减少性紫癜(ITP)正在逐渐受到关注，特别是儿童ITP，有研究报道，儿童ITP的发病率为1.9/10万～6.4/10万[1]。ITP的临床表现以皮肤黏膜出血为主，伴随着血小板数目异常减少和出血时间明显延长等。儿童ITP的预后较成人ITP的预后好，但仍有10%左右的患儿临床转归不佳，需长期使用激素等治疗，严重影响患者的生活。目前，对于该病的机制研究主要集中在免疫介导的血小板异常[2]。体液免疫介导的抗血小板抗体生成和细胞免疫介导的T淋巴细胞相关细胞因子的水平紊乱在ITP的发病中起到关键作用[3]。维生素D3主要参与钙磷代谢的调节，其在肝脏代谢为25-羟维生素D3[25(OH)D3]，随后在肾脏代谢为1,25-羟维生素D3[1,25(OH)2D3]，进而具有生物学活性并发挥作用[4]。有研究提示，有活性的维生素D3能够通过其受体对淋巴细胞等免疫细胞进行效应调节，进而影响机体的T淋巴细胞相关细胞因子水平[5-6]。但是目前关于25(OH)D3与ITP患儿T淋巴细胞相关细胞因子水平间关系的研究较少，本研究通过测定患儿和健康儿童25(OH)D3和T淋巴细胞相关细胞因子水平，旨在探讨维生素D3在ITP发生、发展中的作用，为临床的治疗提供参考依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 将2017年8月至2019年9月于本院就诊的ITP患儿共127例纳入研究作为患儿组，患儿均符合《儿童原发性免疫性血小板减少症诊疗建议》中原发性ITP的诊断标准[7]。排除标准：(1)合并其他疾病，如再生障碍性贫血和白血病等；(2)ITP复发或者慢性ITP患儿；(3)近1个月内使用过相关药物治疗，如维生素D3和糖皮质激素等。患儿组男75例、女52例，年龄1～9岁、平均(4.0±1.2)岁。同时，根据血清25(OH)D3水平，将127例患儿分为缺乏组(低于30 nmol/L)、降低组(30～50 nmol/L)和正常组(高于50 nmol/L)。另外，将60例于本院门诊体检的健康儿童纳入研究作为对照组，男35例、女25例，年龄1～9岁、平均(4.0±1.1)岁。纳入研究的所有患儿及家属均对本研究知情同意并签署知情同意书。本研究经本院伦理委员会批准通过。

1.2方法

1.2.1患儿的治疗 以1 g/(kg·d)注射人免疫球蛋白，连用2 d；以2 mg/(kg·d)口服泼尼松，连用4～6周，如果患儿不能耐受，可以换用甲泼尼龙，以1.6 mg/(kg·d)进行注射，疗程不变。在治疗过程中，应随时关注患儿血小板和皮肤黏膜的出血情况，以便及时作出调整。血小板和出血情况未得到明显改善者，使用地塞米松冲击治疗，0.6 mg/(kg·d)，连用4 d，每月1次，连用4个月[7-8]。观察患儿治疗4个月后的转归情况。

1.2.2标本采集与处理 对所有纳入研究的儿童进行血清标本采集。于清晨空腹采集外周血4 mL，室温放置20 min，使用3 000 r/min的离心机进行离心，取上层血清于—70 ℃冰箱冻存待用。ITP患儿分别于治疗前和治疗4个月后进行标本采集。

1.2.3各项指标的检测 辅助性T淋巴细胞(Th)细胞因子使用美国BD公司的BD FACSantoⅡ流式细胞仪进行检测。采用青岛瑞斯凯尔公司生产的12项细胞因子检测试剂盒及多重微球流式免疫荧光发光法进行白细胞介素(IL)-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的检测。采用罗氏Cobas E602型全自动电化学发光分析仪和配套试剂盒进行25(OH)D3的检测。

1.2.4疗效判定标准 有效：经过治疗后，患儿的血小板计数>30×109/L，至少比基础血小板计数增加2倍且没有出血表现。无效：经过治疗后，患儿的血小板计数<30×109/L或血小板计数增加值不到原来基础值的2倍，或存在出血表现。激素依赖：需要持续使用激素，使血小板计数>30×109/L或避免出血。在进行疗效判断时，至少检测两次血小板计数，两次间隔7 d以上。

2 结 果

2.1两组间25(OH)D3和T淋巴细胞相关细胞因子水平比较 患儿组25(OH)D3、IL-4和IL-10水平低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。患儿组IL-2和IL-17水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。两组间IL-6、TNF-α和IFN-γ比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组间25(OH)D3和T淋巴细胞相关细胞因子水平比较

组别nIL-10(pg/mL)IL-17(pg/mL)TNF-α(pg/mL)IFN-γ(pg/mL)对照组6010.93±1.562.55±0.414.95±0.967.34±1.20患儿组1273.02±0.7912.40±1.935.40±1.148.08±1.32P<0.05<0.05>0.05>0.05

2.2不同25(OH)D3水平ITP患儿T淋巴细胞相关细胞因子比较 由于患儿组与对照组25(OH)D3、IL-2、IL-4、IL-10和IL-17水平比较差异有统计学意义(P<0.05)。故对不同25(OH)D3水平患儿组间进行IL-2、IL-4、IL-10和IL-17水平的比较。不同25(OH)D3水平的患儿组间IL-2、IL-4、IL-10和IL-17水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。2.3治疗4个月后有效组和无效组间25(OH)D3及T淋巴细胞相关细胞因子水平比较 125例患儿治疗4个月后的转归情况：有效111例(有效组)，无效12例(无效组)，激素依赖4例。有效组25(OH)D3、IL-4、IL-10水平高于无效组，差异有统计学意义(P<0.05)。有效组IL-2和IL-17水平低于无效组，而IL-4、IL-10的水平高于无效组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表2 不同25(OH)D3水平的ITP患儿T淋巴细胞相关细胞因子水平比较

表3 治疗4个月后有效组和无效组间25(OH)D3及T淋巴细胞相关细胞因子水平比较

3 讨 论

ITP的发病机制复杂多样，目前的研究已经证实，体液免疫介导的血小板抗体生成与细胞免疫过程中的Th1/Th2比例失衡是其重要的发病原因[2]。但是ITP患者面对激素等治疗手段有不同反应，而且后期临床转归也不完全相同，因此ITP的发病机制仍需要更加深入的研究，特别是需要关注急性ITP向慢性发展过程中各项检测指标的变化。维生素D3在机体中经过肝脏和肾脏的代谢生成25(OH)D3和1,25(OH)2D3。有研究证实，25(OH)D3和1,25(OH)2D3能够调节Th1和Th17等T淋巴细胞的激活，进而影响T细胞分化，参与了类风湿关节炎等自身免疫性疾病的发生、发展[8]，而Th1细胞与ITP具有直接的关系，故探讨25(OH)D3与ITP患儿的T细胞相关细胞因子表达的关系具有较大的临床意义。

本研究显示，与对照组比较，患儿组Th1类细胞因子IL-2水平明显升高，这表明Th1处于高度激活状态；Th17类细胞因子IL-17水平明显升高，这提示Th17处于高度激活状态；而Th2类细胞因子IL-4和IL-10水平明显下降，这说明Th2细胞处于激活抑制状态。在本研究中，患儿组Th1/Th2处于升高状态，这个比例升高，表明患儿Th1处于优势，这与LAZARUS等[9]的研究一致。但是有研究发现，Th1优势可能并不明显，甚至倾向于Th2，这说明在儿童ITP患者中Th1/Th2比例失衡确实存在，但是这种失衡具有明显的差异性，可能会随着群体的差异性而出现明显的异质性[10-12]。Th17是一类CD4阳性的T淋巴细胞，其能够产生IL-17，在炎性损伤和非特异性免疫中具有重要的作用，但是Th17在ITP患儿中的水平变化仍然具有较大的争议，不同ITP的群体可能表现出截然相反的结果[12-14]。Th1与Th17诱导免疫应答，而Th2抑制免疫应答，介导免疫耐受，维持免疫调节的平衡，在本研究中显示ITP患儿Th1和Th17活化，免疫应答强度增强，而Th2抑制，免疫应答的限制减弱，是ITP发生的重要原因。

本研究中，以25(OH)D3水平高低对ITP患儿进行分组，检测结果显示，缺乏组Th1和Th17类细胞因子IL-2和IL-17水平更高，说明Th1和Th17的激活更加明显，机体的免疫应答更加强烈，这对具有明显自身免疫倾向的ITP患儿更加不利。而且抑制免疫应答和介导免疫耐受的Th2类细胞因子IL-4和IL-10在缺乏组中的降低程度更加明显，Th1/Th2的比例失衡更加显著。25(OH)D3水平与ITP患儿T淋巴细胞相关细胞因子水平有关，可能的原因是25(OH)D3能够促进Th1/Th2和Th17的成熟分化，减少促炎性细胞的异常激活，促进抑炎性细胞的成熟和稳定，最终达成一种特殊的内稳态[14-16]。对治疗无效的12例ITP患儿进行分析，结果显示治疗无效的患儿25(OH)D3、IL-4和IL-10水平明显降低，而IL-2和IL-17水平明显升高。这说明不仅Th1、Th2和Th17比例的失衡是ITP发生、发展和预后的重要影响因素，25(OH)D3水平也可能是急性ITP迁延不愈，并向慢性转变的重要因素。虽然随访4个月的时间可能不够，因为不能完全反映ITP患儿的最终临床转归，但是治疗4个月无效能够预测其慢性转归的可能，故对临床具有指导意义。

综上所述，ITP患儿的25(OH)D3水平存在明显的下降，与T淋巴细胞的相关因子水平有关。25(OH)D3水平可能是儿童ITP治疗效果和临床转归的影响因素，但是具体机制仍有待进一步的研究。