甘肃地区叶酸代谢相关酶MTHFR、MTRR基因多态性研究

包丽娥，申东生，杨 勇，张宏磊，郭晓晓

甘肃金域医学检验暨病理诊断所,甘肃兰州 730070

叶酸属于B族维生素，是机体必需的营养物质之一，人体无法合成，需经过多种酶的催化才具有代谢活性[1]，亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)和甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)是参与体内叶酸代谢的关键酶。MTHFR主要功能是将5,10-亚甲基四氢叶酸转化为5-甲基四氢叶酸，5-甲基四氢叶酸是同型半胱氨酸再次甲基化为蛋氨酸的甲基供体[2-3]，MTHFR C677T、MTHFR A1298C位点突变使酶活性降低[4]，造成叶酸水平降低及高同型半胱氨酸血症；若MTRR基因发生变异，就会引起血浆同型半胱氨酸水平升高MTRR A66G位点GG基因型与AA基因型相比，酶活性降低了4倍[5]，一项实验研究证实MTRR A66G位点多态性是高同型半胱氨酸水平的风险因素[6]。大量流行病学和临床研究都证实高同型半胱氨酸水平是动脉粥样硬化、心肌梗死、脑卒中及外周血管病的独立危险因素[7-8]。同时，慢性的细胞内同型半胱氨酸水平升高可导致腺苷蛋氨酸与腺苷同型半胱氨酸的比值降低，使甲基转移酶受抑制而出现低甲基化，可造成染色体不分离，与出生缺陷密切相关，如唐氏综合征、唇腭裂、神经管缺陷等新生儿缺陷[9-10]。本研究以甘肃地区育龄女性为研究对象，对受检者MTHFR C677T、A1298C位点和MTRR A66G位点的基因型进行了分析，旨在获取育龄女性人群中MTHFR和MTRR的基因多态性特征，从而为当地制订叶酸补充方案提供参考依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 将2018年9月至2019年9月甘肃各地区进行叶酸代谢能力检测的育龄女性纳入研究，共4 935例，年龄16～45岁，民族不限。抽取纳入研究者外周静脉血2 mL于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中。送检标本若不能马上检测则置于4 ℃保存,并在1周内完成检测。

1.2方法

1.2.1多态性位点基因的检测 使用MTHFR C677T、MTHFR A1298C和MTRR A66G基因检测试剂盒(PCR-金磁微粒层析法,购自西安金磁纳米生物技术有限公司)进行检测，严格按试剂盒说明书进行操作。从人外周血细胞中提取基因组DNA，利用等位基因特异性聚合酶链反应(AS-PCR)获得MTHFR C677T、MTHFR A1298C和MTRR A66G位点突变或未突变的等位基因扩增片段，使用的PCR仪器为ABI7500型。具体步骤：将20 μL蛋白酶K溶液加入2 mL离心管的管底，然后依次加入100 μL全血、200 μL裂解液，用涡旋振荡器混合15 s，56 ℃水浴20 min；向样品中依次加入300 μL结合液、25 μL的磁性微粒，涡旋混匀，室温静置5 min；磁性分离5 min，弃上清液；从磁性分离器上取出离心管，加入400 μL清洗液Ⅰ，涡旋混匀，磁性分离至上清液澄清，重复本步操作，以400 μL清洗液Ⅰ重复清洗1次；从磁性分离器上取出离心管，加入400 μL清洗液Ⅱ，涡旋混匀，磁性分离至上清澄清，弃上清液，将其室温晾干；向管中加入100 μL洗脱液，涡旋混匀，56 ℃水浴5 min；将离心管置于磁性分离器上，将上清液(分离纯化得到的DNA溶液)转移到2 mL离心管中；将制备好的DNA溶液直接加入于已配制好的PCR反应体系：突变(标记为“M”)管和野生型(标记为“WT”)管中，进行PCR检测。PCR程序设置如下：50 ℃ 2 min，95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，65 ℃ 1 min，共26个循环；65 ℃ 10 min，4 ℃保存。最后，取出PCR产物，于2～8 ℃放置。从密封袋中取出检测卡，将待测样本管中的PCR产物滴加在检测卡对应的样品垫处，放置2～5 min，然后对结果进行判读。根据检测线(T线)是否出现相应条带判读各个位点的基因型，若M管产物在试纸条T线处不出现条带而WT管产物出现条带则为野生型，反之则为纯合突变型，若两管产物均在T线处出现条带则为杂合突变型。

1.2.2观察指标 采用Hardy-Weinberg平衡分析MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G基因多态性是否符合遗传平衡。计算叶酸代谢相关基因各多态性位点(MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G)的基因型频率和等位基因频率。将纳入研究的4 935例育龄女性分成不同年龄段的人群，即<20岁、20～<25岁、25～<30岁、30～<35岁、≥35岁，比较各年龄段人群间上述基因多态性位点基因型分布。将纳入研究的育龄女性按区域来源(酒泉、张掖地区，武威地区，定西、临夏地区，甘南地区，陇南、天水地区和平凉地区)分组进行比较，观察各区域来源人群间上述基因多态性位点基因型分布。将本研究的等位基因频率与其他地区的相应数据(均来自文献[11])进行比较。

1.3统计学处理 使用SPSS23.0统计软件进行数据处理，计数资料以例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1Hardy-Weinberg平衡分析 将纳入研究人群的MTHFR C677T、A1298C位点和MTRR A66G位点的基因多态性分布进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验，均符合遗传平衡(P>0.05)，见表1，表明样本具有本区域群体代表性。

表1 叶酸代谢相关基因多态性位点的Hardy-Weinberg遗传平衡检验(n)

2.2叶酸代谢相关基因的多态性分析 MTHFR C677T位点：CC、CT及TT基因型频率分别为29.6%(1 461/4 935)、49.3%(2 435/4 935)、21.1%(1 039/4 935)；C等位基因频率为54.3%，T等位基因频率为45.7%。MTHFR A1298C位点：AA、AC及CC基因型频率分别为68.9%(3 401/4 935)、28.1%(1 384/4 935)、3.0%(150/4 935)；A等位基因频率为82.9%，C等位基因频率为17.1%。MTRR A66G位点：AA、AG及GG基因型频率分别为49.5%(2 444/4 935)、43.5%(2 147/4 935)、7.0%(344/4 935)，A等位基因频率为71.3%，G等位基因频率为28.7%。

2.3各年龄段间基因多态性位点基因型分布比较 甘肃地区各年龄段间育龄女性MTHFR C677T、A1298C，MTRR A66G位点的基因型分布比较，差异均无统计学意义(χ2=5.579、9.593、6.073，P>0.05),见表2～4。

表2 甘肃地区各年龄段间育龄女性MTHFR C677T位点基因多态性比较[n(%)]

表3 甘肃地区各年龄段间育龄女性MTHFR A1298C位点基因多态性比较[n(%)]

表4 甘肃地区各年龄段间育龄女性MTRR A66G位点基因多态性比较[n(%)]

2.4甘肃地区各区域间育龄女性基因多态性位点基因型分布比较 甘肃地区各区域间育龄女性MTHFR C677T、A1298C，MTRR A66G位点基因型分布比较，差异均无统计学意义(χ2=16.380、14.274、10.089，P>0.05),见表5～7。

表5 甘肃地区各区域间育龄女性MTHFR C677T位点基因多态性比较[n(%)]

表6 甘肃地区各区域间育龄女性MTHFR A1298C位点基因多态性比较[n(%)]

表7 甘肃地区各区域间育龄女性MTRR A66G位点基因多态性比较[n(%)]

2.5本研究与省外其他地区数据的比较 本研究中MTHFR、MTRR多态性位点等位基因频率与长春、新疆、廊坊、银川、淄博、郑州、苏州、湖北、眉山、湘潭、云南、南宁、阳江、海南等地区比较差异有统计学意义(P<0.05)；甘肃地区育龄女性MTHFR C677T位点等位基因频率与长春、廊坊、淄博、郑州、眉山、湖北、湘潭、云南、南宁、阳江、海南等地区比较，差异有统计学意义(P<0.05)，与新疆、银川、苏州等地区比较，差异无统计学意义(P>0.05)。MTRR A1298C位点等位基因频率与长春、廊坊、淄博、郑州、湖北、湘潭、南宁、阳江、海南等地区比较，差异有统计学意义(P<0.05)，与新疆、银川、苏州、眉山、云南等地区比较，差异无统计学意义(P>0.05)。MTRR A66G位点等位基因频率与长春、廊坊、银川、淄博、郑州、眉山、湖北、湘潭、云南、南宁等地区比较差异有统计学意义(P<0.05)，与新疆、苏州、阳江、海南等地区比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨 论

叶酸在DNA合成、甲基化修饰及个体生长发育和基因表达调控等方面发挥着重要作用[1]。据统计，我国出生缺陷总发生率约为5.6%，出生缺陷总发生率呈上升趋势；出生缺陷不仅是造成儿童残疾的重要原因，也日渐成为儿童死亡的主要原因[11]。有研究表明，叶酸代谢相关酶MTHFR和MTRR基因多态性与不良孕产结局有一定的关系[12]。MTHFR基因多态性突变位点已有近20种，其中最为重要的是C677T和A1298C这两个位点[13]。MTRR基因最常见的一个多态性位点是A66G，它会导致多肽链第22位的异亮氨酸被甲硫氨酸取代。体外研究表明，要想使甲硫氨酸合成酶达到最大反应速度，A66G位点变异型相较于野生型酶反应体系中使用MTRR与甲硫氨酸合成酶的比例要高3～4倍，意味着该位点对MTRR的活性影响非常之大[14]。

本研究显示，甘肃地区MTHFR C677T位点突变率较高，CC基因型频率为29.6%，而杂合突变基因型频率较高，为49.3%；MTHFR A1298C位点突变率较低，AA基因型频率为68.9%，其纯合突变基因型频率仅为3.0%；MTRR A66G突变率较高，AA基因型频率为49.5%，杂合突变基因型频率较高，为43.5%，纯合突变基因型频率为7.0%。甘肃地区育龄女性各年龄段间上述基因多态性位点基因型构成比分布比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；甘肃地区育龄女性各区域间上述基因多态性位点基因型构成比分布比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。有研究发现，中国汉族人群C677T的突变频率为40%,MTHFR C677T等位基因频率呈现地理梯度性变化，突变频率随着纬度的增加先增加再减少；TT基因型频率在南方地区为6.6%,中部地区为14.2%,北部地区为21.3%,最北部地区为15.0%[15]。甘肃地区育龄女性的上述基因多态性位点的基因型构成比分布与年龄及省内地理位置无关，可能是因为同处于我国西北地区；而上述基因多态性位点的基因型频率与国内非西北地区的部分地区间存在地域性差异。

叶酸是一种能够预防神经管畸形的保护剂[16]，补充叶酸可以将神经管畸形的发病率降低70%[17]。叶酸补充是我国目前针对新生儿神经管畸形的主要预防措施之一。孕妇体内叶酸水平受饮食习惯、地域、遗传等因素的影响，对营养的需求因人而异，对备孕及已怀孕的女性进行叶酸利用能力的评估，有助于了解机体对叶酸的利用能力，从而制订个性化的营养干预方案。