血清PCSK9在2型糖尿病患者中的作用机制及临床意义*

郭娟英，刘传芳，肖 丽，杜 媛，方 菲，郑明侠，尚粉青△

1.西安建筑科技大学校医院内分泌科，陕西西安710000；2.陕西省西安市第一医院/西北大学附属第一医院心血管内科，陕西西安710002

前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)是一种细胞内转化酶或脱羧酶。近年来国内外研究表明血清PCSK9与动脉粥样硬化显著相关[1]。一项大型临床研究提示，PCSK9抑制剂可有效降低血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平，降低心血管事件发生风险，对于超高危患者有更显著的获益[2]。而2型糖尿病一直是心血管疾病发生、发展的超高危险因素，该病患者冠状动脉血管弥漫性病变多见，小血管病变多见，支架内再狭窄亦多见[3]。因此本研究着重探讨2型糖尿病患者血清PCSK9水平升高的作用机制及意义，为今后进一步有效防治心血管疾病提供理论依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2019年1-10月西安建筑科技大学校医院体检者中的2型糖尿病患者74例作为糖尿病组，同时选取与其年龄、性别相匹配的体检健康者76例作为对照组。2型糖尿病诊断标准参考《中国2型糖尿病防治指南(2017年版)》[4]。排除标准：确诊冠心病、高脂血症者，恶性肿瘤、严重感染、严重的心肝肾功能损害、甲状腺功能疾病，近期服用他汀类及类固醇激素药物者。两组对象一般情况比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究通过西安建筑科技大学校医院伦理委员会审核批准。

1.2仪器与试剂 血清PCSK9检测使用的酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒购自Elabscience公司。主要仪器包括实时荧光定量PCR(qPCR)仪及梯度PCR仪(美国Applied Biosystems公司)、Western blot电泳仪、电泳槽、自动洗片机(柯达公司)。主要试剂：葡萄糖粉购自西安市第一医院药剂科；Betulin购自Sigma公司。固醇调节元件结合蛋白2(SREBP2)、PCSK9、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)等qPCR引物由擎科生物有限公司合成，引物序列见表1。siRNA-SREBP2由生工生物公司合成。SREBP2抗体、PCSK9抗体均购自Cell Signaling公司，β-actin抗体购自Santa Cruz公司。蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂购自罗氏公司；ECL发光液购自Vazyme公司和Millipore公司；Trizol试剂购自Invitrogen公司；HiScriptTMqPCR SuperMix反转录试剂盒购自Vazyme公司；PCR DNA聚合酶购自Vazyme公司，其他试剂为国产分析纯试剂。

表1 PCR引物序列

1.3方法

1.3.1人肝癌细胞株HepG2的培养及处理 HepG2细胞株由西安交通大学医学部心血管研究中心赠予。使用DMEM培养基培养，置于37 ℃、5%CO2中培养，胰蛋白酶消化传代。以不同水平葡萄糖(高水平：30 mmol/L；低水平：5 mmol/L)孵育HepG2细胞24 h。抑制SREBP2：使用SREBP2的特异性抑制剂Betulin或转染SREBP2 siRNA(10 μmol/L)抑制细胞SREBP2。

1.3.2血清学检测 血清PCSK9水平的检测采用ELISA。空腹血糖(FPG)、糖化血红蛋白(HbA1c)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、LDL-C、同型半胱氨酸(Hcy)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)等临床生化指标送西安建筑科技大学校医院检验科进行检测。HbA1c的检测采用Alere Afinion AS100型特种蛋白干式免疫散射色谱分析仪。

1.3.3Western blot检测 6孔板中的细胞先用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗2遍，加入蛋白裂解液约120 mL，使用液氮进行冻融3次，在4 ℃下进行离心，离心速度为12 000 r/min，离心时间为15 min，之后取上清液，再使用ABC法对蛋白水平进行测量。之后加入上样缓冲液，设置温度为95 ℃，8 min后蛋白变性。使用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(其中下层胶50 mA、90 min，上层胶30 mA、30 min)，转膜电流为230 mA，时间为1 h，再用5%脱脂牛奶进行封闭，时间为1 h，在4 ℃下孵育一抗进行过夜，使用TTBS液洗3遍，每遍时间为5 min；在室温1 h下孵育二抗；使用ECL发光，自动洗片机洗片。标定蛋白条带后扫描、分析。

1.3.4qPCR检测 先用PBS清洗6孔板中的细胞2遍，之后加入Trizol液，提取RNA，使用紫外分光光度计检测RNA水平。参照HiScriptTMqPCR SuperMix反转录试剂盒说明书取2 μg总RNA进行反转录，制备cDNA。然后进行qPCR检测，采用2-ΔΔCt计算目的基因的相对表达水平。

2 结 果

2.1对照组与糖尿病组血清PCSK9水平比较 糖尿病组血清PCSK9水平高于对照组[(22.22±9.63)ng/mLvs.(12.46±6.22)ng/mL，P<0.001]。

2.2对照组与糖尿病组一般资料及临床生化检测结果比较 糖尿病组TC、TG、LDL-C、FPG、HbA1c、HDL-C、hs-CRP水平均高于对照组(P<0.05)；两组间Hcy水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 对照组与糖尿病组一般情况及相关生化检测结果

组别nHDL-C(x±s,mmol/L)LDL-C(x±s,mmol/L)FPG(x±s,mmol/L)HbA1c(x±s,%)Hcy(x±s,μmol/L)hs-CRP(x±s,mg/L)对照组761.07±0.142.34±0.515.04±0.865.2±1.0510.35±2.961.65±0.69糖尿病组741.10±0.252.62±0.74*7.63±1.53*7.67±1.83*10.41±2.544.12±1.32*

2.3血清PCSK9水平与LDL-C、hs-CRP水平的相关性 血清PCSK9水平与LDL-C、hs-CRP水平呈正相关(r=0.593、0.424,P<0.05)，见图1。

注：A为PCSK9水平与LDL-C水平的相关性分析；B为PCSK9水平与hs-CRP水平的相关性分析。图1 血清PCSK9水平与LDL-C、hs-CRP水平的相关性分析

2.4不同水平葡萄糖孵育对HepG2细胞PCSK9、SREBP2表达水平的影响 采用不同水平葡萄糖孵育HepG2细胞后，qPCR及Western Blot检测PCSK9的表达情况，结果显示高水平葡萄糖孵育细胞的PCSK9、SREBP2表达水平高于低水平葡萄糖孵育的细胞(P<0.05)，见图2。

注：与5 mmol/L比较，*P<0.05，**P<0.01；A为qPCR检测SERBP2和PCSK9的mRNA相对表达水平；B为Western blot检测PCSK9、SREBP2的表达情况;5 mmol/L、30 mmol/L为葡萄糖水平。图2 高水平葡萄糖对SREBP2和PCSK9表达的影响

2.5抑制SREBP2后对PCSK9表达的影响 抑制SREBP2后，HepG2细胞PCSK9表达水平降低(P<0.05)，见图3。

注：与5 mmol/L比较，**P<0.01；与30 mmol/L比较，#P<0.05，##P<0.01；A为qPCR检测PCSK9的mRNA相对表达水平；B为Western blot检测PCSK9的表达情况;5 mmol/L、30 mmol/L为葡萄糖水平。图3 抑制SREBP2对PCSK9表达的影响

3 讨 论

已有的研究表明，PCSK9水平与冠心病严重程度呈正相关[5]。冠心病患者血清PCSK9水平显著高于健康人群；多支血管病变患者PCSK9水平明显较双支血管病变或单支血管病变患者高；PCSK9与体质量指数、年龄、TG、TC、收缩压、FPG、LDL-C、Gensini评分等呈正相关[6]，PCSK9水平与hs-CRP及IL-10水平呈正相关[7]。PCSK9抑制剂在他汀类药物的基础上可进一步降低LDL-C水平，能逆转冠状动脉斑块的形成，降低主要心血管事件风险；PCSK9抑制剂治疗获益程度随时间不断增加，第1年相对风险降低16%，大于1年后相对风险可降低至25%；PCSK9抑制剂可以给“极高风险”的动脉硬化性心血管疾病患者带来更显著的心血管获益[2]。

2型糖尿病作为冠心病的危险因素，可导致弥漫性的血管病变，合并糖尿病的冠心病患者较单纯冠心病患者的血管病变更严重，植入支架数量也更多，支架内再狭窄发生率也更高，预后较差[4]。本研究证实，糖尿病患者血清PCSK9水平明显升高，而且与血清LDL-C、hs-CRP水平呈正相关，与刘云涛等[8]的报道一致。糖尿病患者血清PCSK9水平与血清胰岛素、HbA1c水平显著相关[9-10]，而他汀类药物可以上调PCSK9水平[11-12]，PCSK9又会限制其降低LDL-C水平的药理作用。因此糖尿病患者血管病变及并发症的发生可能与血清PCSK9水平密切相关。

本研究进一步探讨了2型糖尿病患者血清PCSK9水平升高的作用机制及临床意义。肝脏是合成和分泌PCSK9的重要器官，因此本研究使用了HepG2细胞进行机制研究，高水平葡萄糖孵育HepG2细胞使细胞PCSK9表达增加。PCSK9的表达由转录因子SREBP2调控，其通过结合基因启动子区域中的固醇调节元件调节PCSK9的表达。当细胞胆固醇水平降低时，SREBP2被激活。激活的SREBP2使PCSK9表达水平升高。PCSK9结合肝细胞表面的低密度脂蛋白受体并使其降解，从而使LDL-C水平升高。糖尿病患者血液的高水平葡萄糖可激活SREBP2并促进PCSK9表达，从而限制了他汀类药物的降脂效果。PCSK9与炎症[13]的密切关系可能是糖尿病患者血管病变严重的原因之一。