猪圆环病毒2型繁殖与呼吸综合征病毒混合感染诊断

罗布扎西，聂民财，徐志文，周远成

（1.西藏自治区错那县浪坡乡农牧综合服务中心，西藏 错那 856700；2.四川农业大学动物医学院，四川 成都 611130；3.四川农业大学动物医学院动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川 成都 611130；4.四川省畜牧科学研究院畜禽生物制品四川省重点实验室，四川 成都 610066）

猪圆环病毒是圆环病毒科圆环病毒属的单股环状负链DNA病毒，是目前已知的最小的动物DNA 病毒，主要分为三个血清型，其中2 型的致病力最强。PCV2（圆环病毒2 型）在猪群中传染性较强，能够通过口腔、呼吸道进行传播，怀孕母猪感染后亦可经胎盘引起垂直传播。

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是动脉炎病毒科动脉炎病毒属的单股正链RNA 病毒，PRRSV于1987年首次在美国发现。PRRSV只感染猪，各种日龄、品种的猪都可以感染此病毒，其中日龄在1月以内的仔猪和妊娠母猪最易感。病仔猪以出现呼吸道症状为主，感染母猪则出现繁殖障碍。

1 材料与方法

1.1 病料 病料采集于出现喘气、发烧和腹泻症状的猪，包括患猪的血液、肠系膜淋巴结、脾脏、肺脏以及小肠等。

1.2 试剂与材料 DL 2 000 Marker、dd H2O、Trizol 细胞裂解液、RT-PCR 反转录试剂盒、2×Taq PCR Master Mix，通用型基因组DNA提取试剂盒。

1.3 样品处理 血液样品分装于无菌EP 管中，5 000 r∕min离心5 min，取上清液备用。

淋巴结、脾脏、肺脏和小肠等组织样品剪碎、研磨后加3 mL PBS 制成组织悬液，放置于-20 ℃冻融3次，12 000 r∕min离心5 min，取上清液备用。

1.4 引物设计与合成 根据GenBank 已登录的伪狂犬病毒（PRV）、猪瘟病毒（CSFV）、流行性腹泻病毒（PEDV）、传染性胃肠炎病毒（TGEV）、轮状病毒（PoRV）、细小病毒（PPV）、δ-冠状病毒（PDCoV）、圆环病毒2 型（PCV2）、繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的基因序列，利用DNAMan 软件分析保守序列并设计引物（表1）。

1.5 核酸提取及PCR 检测（表2、表3）总RNA提取：使用Trizol 法提取病料的总RNA，得到总RNA 后进行反转录得到cDNA，使用CSFV、PEDV、TGEV、PORV、PRRSV 特异性引物分别进行RT-PCR检测。

表2 RT-PCR/PCR反应体系

表3 RT-PCR/PCR反应程序

总DNA 提取：使用通用型DNA 提取试剂盒提取病料总DNA，使用PRV、PPV、PCV 特异性引物进行PCR检测。

2 结果

通过对几种病毒进行特异性PCR 检测，CSFV、PEDV、TGEV、PPV、PRV、PORV 结果均为阴性，PCV2 PCR 结果中均为阳性（见图1），PRRSV RT-PCR 结果中血液样本和肺脏样本表现为阳性（见图2）。根据检测，诊断本次猪病为PCV和PRRSV混合感染所致。

图1 PCV2 PCR检测结果

图2 PRRSV RT-PCR检测结果

3 小结

猪圆环病毒和繁殖与呼吸综合征病毒均能攻击猪只的免疫系统，使患病猪出现免疫抑制，进而继发感染其他病毒或细菌，出现混合感染。生产中猪圆环病毒和繁殖与呼吸综合征病毒混合感染较常见。

当猪发生圆环病毒病和繁殖与呼吸综合征时，猪因免疫抑制而继发感染其他疾病是给猪场造成严重损失的主要原因。当猪出现二病感染时应当加强其他病毒性疾病和细菌性疾病的防控。

防控发病应将病死猪及污染物无害化处理；病猪和可疑病猪单独隔离饲养，并加强其他常见病毒性疾病的免疫；加强环境消毒，每天对猪场进行两次消毒；做好猪场人员的管理，严禁外来人员进入养殖区域；做好饲养管理，避免猪因应激反应而导致免疫力下降。