棉花杂交种纯度SSR分子检测技术研究与应用

柴莉英 郭志军 马宝玲 张珂珂 周关印

（中棉种业科技股份有限公司 河南郑州450001）

棉花生产关乎着棉农的切身利益， 对棉纺织工业稳定发展具有重要意义， 一定程度上还拉动了我国经济贸易的发展和进步。 随着棉花科研育种水平的不断提高，早熟、高产、优质、抗逆等各种优良性状获得聚合与提高， 满足了我国多种生态条件和种植模式的需要[1]。 我国目前棉花生产上主要种植包括早熟棉、中早熟棉、中熟棉等不同熟制要求的常规棉与杂交棉两大栽培种类型， 且转基因抗虫棉的育成在一定程度上加快了棉种产业化推广进程， 提升了我国棉花产业的可持续发展力[2]。

1 我国棉花产业现状

“十二五”时期以来，随着转基因技术研究的深入和棉花种质资源材料创新， 我国新审定的棉花品种急剧增长， 科研育种者为保护自己的知识产权不受侵犯， 国家植物新品种权保护的申请数量也与日俱增。 因此，我国棉花品种“多、乱、杂”的状况仍然是棉花生产中非常突出的问题， 切实做到棉花品种种植区域化布局也十分困难。 借助新的种子真实性和纯度检测技术、加大假冒伪劣种子抽查与检验力度、切实加强棉种市场监管， 成为维护棉花育种家权益和保护棉农根本利益的重要保障措施。

棉花杂交种利用杂种优势聚合多种优良性状于一体，提高产量和改进品质，属于高效品种。 好的棉花杂交种在生活力、繁殖力、适应性上具有明显的超亲优势。 但杂交种制种用工需求大，成本高，一旦出现问题，影响极大。 如果棉花杂交种子的纯度等到大田长成植株时再通过形态性状进行鉴定， 一旦出现纯度不好或者掺杂使假，不仅会给棉农造成损失，对市场上的种子质量监督和指导也失去了意义。 棉花品种的真实性和纯度差异仅仅依靠传统的检测技术与方法很难进行高效而准确的判定和区分， 致使最近几年杂交棉种生产和市场上假冒伪劣种子时有发生，为棉花生产和棉农种植带来极大损失。 因此，采取高效而快捷的现代分子技术方法， 对杂交棉花种子真实性和纯度进行检测， 加强制种基地与棉种市场的监管是重要途径。

棉花品种的真实性和纯度至关重要， 一方面它直接影响着棉花的产量和效益， 另一方面也关系到一个棉种企业的质量信誉。

2 我国棉花品种检测技术发展

2.1 形态鉴定

棉花种子检测技术往往以形态学鉴定为基础，可以从籽粒、种苗和植株3 个不同形态阶段来鉴定。籽粒鉴定应用范围有限， 种苗鉴定通常用于室内发芽率等鉴定。 而植株形态测定通常作为棉种真实性和田间纯度鉴定的重要方法， 在棉花生长季节某些特定时期，通过棉花的株型、铃型、叶形、绒毛、茎秆、苞叶等主要性状来综合判定， 该方法优点是田间直接观察品种真实性及相关形态特征， 缺点是需时较长， 田间植株形态性状表达易于受基因型与环境互作影响，某些数量性状会出现非遗传差异[3]。 一些质量性状会因调查时间的早晚而得出不同结论， 其鉴定结果又与鉴定人员的熟练程度有关， 难以满足在调查过程中快速测定的需要，费时费力，可靠性和时效性受到一定限制。

2.2 DNA 分子标记鉴定技术

分子生物学的发展使DNA 分子标记作为种子检测新的技术手段更具有优势。 在棉花品种检测中遇到的分子技术主要有RAPD 技术、SSR 技术、AFLP技术、RFLP 技术及SNP 技术等。目前，应用最广泛的是SSR（简单重复序列）技术，以其简单、快捷、分辨力强等优势特点得以普遍应用。 近年来，采用SSR 分子标记技术进行纯度鉴定、 真实性检测及分子育种等应用显著增多。 从鉴定的可信度与时效性考虑，SSR分子标记技术相比传统的检测方法与技术， 更能满足棉花品种纯度检测与市场监管的需要。

3 利用SSR 检测技术的优势

棉花品种真实性和纯度田间小区种植鉴定存在所需时间较长、 易于受环境影响等致命缺陷， 这种“末端鉴定”的事后控制质量控制模式，已无法满足棉花杂交制种基地制种农户种子收购、 种子加工和质量检验等工作的需要， 也不利于品种管理部门对种子市场质量的监督抽查和管理。 中棉种业对大容量、 多批次来自制种基地农户的杂交一代棉花种子纯度进行SSR 分子检测， 与田间种植纯度鉴定结果进行比对分析， 验证了SSR 分子标记纯度鉴定的相关性、准确性及可靠性。 SSR 分子标记技术在棉花杂交种真实性和纯度鉴定上应用，能够为建立“事前控制”的棉花杂交种生产质量控制模式提供理论基础，为制定棉花品种DNA 指纹鉴定技术标准提供实践依据，为杂交棉花品种育种者、生产者、消费者正当权益提供法律保障， 为我国棉种市场质量监督抽查和管理提供技术支撑。

4 SSR 检测技术在实践中的应用

直接以棉花干种子为DNA 提取试材，既快速又质量好， 尤其适用进行棉花品种SSR 分子纯度快速检测[4]。对中棉种业制种农户的样品进行了SSR 纯度检测和田间小区种植纯度鉴定，受检的91 个制种农户样品中DNA 纯度最高为95.8%，最低50.0%，平均为86.3%，杂株类型中以亲本型为主，占12.5%，初步判断原因是母本去雄不彻底，形成母本自交铃， 也存在少量父本的混杂；而对于田间小区种植纯度鉴定，纯度最高为99.1%，最低57.5%，平均为94.3%，杂株类型也是以亲本型为主，占4.0%，2 种方法的杂株率也都很接近，分别是1.1%和1.7%。2 种试验方法的相关分析表明，其之间呈高度正相关[5]。

由此可知， 在制种环节的主要问题就是母本去雄不彻底导致的自交铃， 和一些原因不明的生物学混杂。 随着分子检测的普及，农民的质量意识增强，懂得分子检测的准确度， 加之公司对不合格种子的处罚加大，严禁不达标种子入库，因此掺杂使假行为减少，总体来看，这些农户批次的种子绝大部分质量都不错。从数据分析，SSR 鉴定的纯度比田间结果低，可能是存在杂合的基因在性状上不表达或者表达不明显，从而导致基因水平上的纯度低于田间的性状表现纯度，也说明了SSR 分子检验更加严格，棉花80%纯度值可以作为SSR 标记纯度优良的一个阈值[6-7]。况且田间鉴定受环境因素影响较大， 一方面由于棉花常异花授粉作物的特殊性，另一方面，检测人员能力、目测标准、操作方式等人为误差对大田纯度结果也有影响。

种子收获后，如果SSR 纯度检测结果差，公司拒绝收购，农户质疑时，公司会让农户亲自监督SSR 检测工作，从取样到结果，让农户亲身感受到分子检验的权威性，避免不必要的质量纠纷。 有必要时还会让农户亲自参与调查来年田间小区种植的纯度鉴定，让农户认识自己制种的纯度与质量。 另外，还可以通过第三方公证检验机构对种子进行仲裁检验， 出具当事双方都认可的检验结果。 种子质量是企业的生命，也是对制种农户的收益保证，对棉花种子市场的安全监管也十分重要[8]。 因此，SSR 分子检测棉花杂交种真实性和纯度技术应用具有广阔前景。

“十四五”期间国家聚焦农业农村领域，围绕优先发展农业农村，解决好“三农”问题，作为棉企，有义务和责任，提高效益，发展自身；促进棉农增收，造福百姓;服务农业，提高中国棉花竞争力。