蓝莓真菌病害种类鉴定

覃 可

（贵阳职业技术学院，贵州 贵阳 550081）

蓝莓又称“越橘”，不仅富含常规营养成分，而且还含有极为丰富的黄酮类和多糖类化合物，因此又被称为“水果皇后”和“浆果之王”[1]。国外在蓝莓营养生长过程中发现了两种主要的叶斑病，即Septoria albopunctata引起的壳孢子病和Gloeosporium minus引起的炭疽病。二者都会减少花芽，影响叶片光合作用，进而降低果实产量[2-7]。在我国辽东地区的蓝莓种植基地，叶斑病发生最早，侵染最广，损失最大，而蓝莓本身的其他病害在国内尚未见报道。2006年9月中旬，在辽东地区的蓝莓种植地发现了一种叶斑病[8]。经鉴定，该病原菌为Alternaria tenulssima，不仅会引起叶片病害，而且会在侵染植株的茎上形成溃疡区。此外，据国外报道[9]，该病原菌还可引起果实采后病害[10]。2006年夏季，辽宁省东部地区发生了严重的叶斑病，对4～6月龄的幼苗危害较大，该病害严重影响了幼苗的培育，经调查，该病原菌是由棒孢杆菌引起的，其真菌寄主范围广，可寄生植物约50多科，特别是棕榈树、乔木、番石榴和茶树等经济作物；受害植物主要表现为叶斑、腐烂、溃疡等症状，严重危害经济作物，给国民经济发展带来巨大损失[10]。目前已经报道的病害种类有僵果病、茎溃疡病和枝条枯萎病、叶斑病、枯焦病毒、花叶病、红色轮状斑点病等，但是贵阳地区种植的蓝莓病害未见报道。因此，调查和鉴定蓝莓病害种类，可为今后的蓝莓病害防治工作奠定基础，并为找到防治方法和途径提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

在贵阳市马铃乡蓝莓基地、惠水县好花红乡蓝莓基地、麻江县蓝莓基地进行病害调查，采集症状典型的新鲜病株供室内鉴定。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离与纯化

对于病株病原菌的分离采用常规组织分离法[11]。从发病的植株上剪下病叶或病茎后，冲洗干净，在叶片或茎部的病健交界处切取1 mm～2 mm×1 mm～2 mm的小块组织，用70%乙醇消毒30 s，再用0.1%浓度的升汞溶液消毒1 min～3 min，然后用无菌水冲洗3次，每次1 min～2 min，将小组织放在灭菌后的滤纸上待干。在无菌条件下将病害组织接在PDA培养基的平板上。经2 d～3 d后，PDA长出菌丝后，对菌丝进行分离提纯。经显微镜观察排除掉杂菌，挑取菌丝进行扩大培养用于提取DNA并把菌丝保存于斜面培养基上。

1.2.2 病原菌的形态学鉴定

观察纯化病原菌菌落形态、颜色、质地以及分生孢子产生与否，对产生分生孢子器的病原菌制作切片，观察分生孢子器、分生孢子形状、颜色等，参照《真菌分类鉴定手册》[12]进行。

1.2.3 PCR扩增

以ITS1和ITS4引物进行PCR扩增，产物送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，测序后得到ITS区序列经Blast并与NCBI数据库中的已知序列进行同源性比较。

1.2.4 致病性测定

分离纯化后的菌种根据柯赫氏法则用针刺的方法刺伤蓝莓健株的叶片将菌丝接种在叶片上。另备上用无菌水做处理的对照组CK。经24 h、48 h、72 h进行观察。再将在自然条件下发病的叶片与在实验室内做回接试验发病后的叶片进行比较，在体视镜下对各自的病斑观察对比，如病害症状特点一致且在显微镜下观察得到分离后的病原菌与自然发病条件下的病原菌一致，即能确定病害。

2 结果与分析

2.1 病害种类鉴定

2.1.1 蓝莓锈病

病害症状：受害叶片上早期出现小的斑点，后叶片正面形成大的斑点，叶背面产生明黄色粉末状小点，为锈孢子。病叶变黄，早期脱落。病菌以菌丝体在桧柏病组织内越冬，春季遇雨水冬孢子吸水膨胀，借雨水传播侵染蓝莓幼嫩组织，桧柏是其中间转主寄主[13]。

病原菌：真菌病害，病原为Pucciniastrum vaccinii.，属担子菌亚门膨痂锈菌属。夏孢子堆叶背生，淡赭色；拟包被半球形，由长形而小的有或无隔膜的细胞组成，高50μm~90μm，直径100μm~125μm；夏孢子上有疏疣，近球形或往往是矩圆形、椭圆形、卵形或梨形，近无色，25μm~30μm×10μm~18μm。冬孢子堆叶背生，在寄主的表皮下，赭色，壳状；冬孢子淡色，2~8胞，近球形或矩圆形，17.5μm~32μm×12μm~25μm。

2.1.2 蓝莓枝枯病

病害的症状：高发于幼枝。该病主要发生在伤口和切口，受害初期会产生红棕色斑点，随着斑点的扩大，枝条开始干枯，逐渐导致整个幼枝死亡。在发病后期，易在病斑上产生密集的小黑斑（分生孢子）。切开受害组织后，维管束组织变成浅棕色，可见白色菌丝体[14]。

病原菌：为棒孢拟盘多毛孢真菌（Pestalotiopsis clavispora.）。自然感染枝上的孢子载体为分生孢子，黑色，单腔，初散生，埋入寄主表皮下，再经表皮暴露，直径50μm～100μm；产孢细胞呈棒状，无色，末端产生分生孢子。分生孢子平直或稍弯，有4个隔膜，5个细胞，分隔处稍缢缩，中隔明显，21.7μm～25.1μm×5.7μm～6.3μm；顶端细胞呈锥形，无色，长3.1μm～3.5μm，基部细胞呈倒锥形，无色，第2和第3细胞为深褐色，壁厚，长11.1μm～11.9μm。第四个细胞呈极浅橄榄色，壁厚，长5.5μm～5.9μm，顶端有2～4根细长丝，长23.8μm～27.2μm，基部有1根细长丝，长4.9μm～6.5μm。分生孢子平均长宽比为3.3～3.914。序列长度为506 bp，与棒孢拟盘多毛孢Pestalotiopsis clavispora.同源性为100%，登录号为gb KP075005.1。

2.1.3 蓝莓叶枯病

病害症状：主要为害叶片，叶片上出现黄褐色小斑，呈圆形或不规则形，叶片边缘褐色，中央灰白色，有明显的同心轮纹，并产生浓黑色小粒点，病界明显，边缘有明显的暗色坏死带。

病原菌：为韦斯梅拟盘多毛孢真菌(Pestalotiopsis vismiae.)，属半知菌亚门腔孢纲黑盘孢目。分生孢子直或稍弯曲，具4个隔膜，5个细胞，分隔处稍缢缩，中间横隔明显，顶端细胞呈锥形，基部细胞呈倒锥形，无色；顶端附属丝2～4根，基部无附属丝。序列长度为461 bp，与韦斯梅拟盘多毛孢Pestalotiopsis vismiae.同源性为100%，登录号为gb KP747698.1。

2.1.4 蓝莓根腐病

病害症状：幼苗至成株期均可发生，苗圃幼苗发生危害重，主要为害根部。毛细根先出现坏死斑，后整个根系变褐腐烂枯死。植株生长缓慢，叶片变黄、干枯，最后植株死亡。定植1～2年的植株也有发生。

病原菌：为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum.）。菌落突起絮状，菌丝白色质密。菌落粉白色，浅粉色至肉色，略带有紫色，由于大量孢子生成而呈粉质。菌落高3 mm～5 mm，小型分生孢子着生于单生瓶梗上，常在瓶梗顶端聚成球团，单胞，卵形；大型分生孢子镰刀形，少许弯曲，多数为3隔。厚垣孢子尖生或顶生，球形[15]。气生菌丝、黏孢团、子座、菌核、均呈各种颜色。菌丝与大型分生孢子上有时有厚垣孢子，厚垣孢子间生或顶生，单个或多个成串或成结节状[16]。序列长度为491 bp，与尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum.同源性为100%，登录号为gb KU056819.1。

2.1.5 蓝莓灰霉病

病害症状：开始从叶尖或叶缘处发病，形成“V”病斑向叶内扩散。后期病叶卷曲干枯，被灰色霉层包裹。果实上初呈水渍状小点，严重时果实干瘪变黑密生灰色霉层[17]。

病原菌：为灰葡萄孢(Botrytis cinerea)。菌落初为白色，质密，随着菌丝增长颜色加深变成深灰绿色，老熟时呈灰褐色，菌丝丝绒状，约7 d在培养基周围及底部形成灰褐色菌核孢子梗细长，直立有隔膜，分生孢子梗无色或淡色，123μm～287μm×10μm～14μm，有分支，顶端膨大成圆形，分生孢子着生于小梗上，分生孢子卵圆形或椭圆形，单细胞，无色或淡色透明。分生孢子8μm~14μm×7μm~11μm[17]。序列长度为510 bp，与灰葡萄孢Botrytis cinerea.同源性为100%，登录号为gb KR055051.1。

3 结论与讨论

经调查，贵阳市马铃乡蓝莓基地、惠水县好花红乡蓝莓基地、麻江县蓝莓基地发现为害蓝莓的主要真菌病害为蓝莓锈病(Pucciniastrum vaccinii.)、蓝莓枝枯病(Pestalotiopsis clavispora.)、蓝霉叶枯病(Pestalotiopsis vismiae.)、蓝莓根腐病(Fusarium oxysporum.)、蓝莓灰霉病(Boteytis cinerea.)。蓝莓引种不久，贵州省内种植年限较短，管理栽培方法较好，因此，并没有发生严重的病害流行传播，对产量影响小。目前各地以打造生态蓝莓种植基地为目的，蓝莓基地病害防治主要以生物防治手段为主，但是单靠栽培管理及肥水管理的农业防治不能彻底根除病害。鉴于蓝莓在我国是一个新的树种，在严格把好检疫关的同时，应借鉴国外多年研究成果，积极开展我国蓝莓病虫害发生规律和防治措施研究，减少病虫害在我国发生。