参芎葡萄糖注射液对低灌注大鼠血-脑脊液屏障通透性的影响

冯佩佩 张倩影 黄 炎 李永杰 刘 坤 李 敏

华北理工大学附属医院药学部，河北唐山 063000

血-脑脊液屏障是由脉络丛组织上皮细胞间的紧密连接所构成，其主要负责外周血与脑脊液之间的物质转运。完整的血-脑脊液屏障结构可有效维持脑组织内环境的稳定和正常的生理功能[1]。近年来国内外研究发现，低灌注可增加血-脑脊液屏障的通透性[2-3]。因此，降低低灌注后引起脑缺血群体的血-脑脊液屏障通透性成为近年来的研究热点。

参芎葡萄糖注射液为一种中西药复方制剂，其主要成分为丹参素和盐酸川芎嗪（人工合成），具有活血化瘀、养血安神的功能，临床上被广泛用于治疗心肌缺血和冠心病，疗效显著[4]。本文通过研究低灌注大鼠及给予参芎葡萄糖注射液干预后血-脑脊液屏障通透性的改变，以探讨参芎葡萄糖注射液对血-脑脊液屏障保护作用的机制。

1 材料与方法

1.1 药物、试剂及仪器

参芎葡萄糖注射液（贵州景峰药业有限公司，20180645）；Trizol（美国Invitrogen 公司，10296-010）；兔抗大鼠Occludin 一抗（北京博奥森生物技术有限公司，bs-10011R）；兔抗大鼠ZO-1 一抗（北京博奥森生物技术有限公司，bs-1329R）；山羊抗兔二抗（北京博奥森生物技术有限公司，bs-0295G-SA）；白蛋白酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（慧嘉生物科技有限公司，201903）；反转录试剂盒（Roche，4897030001）；PCR 试剂盒（Roche，04913850001）。

外科器械（天津市康尔医疗器械有限公司）；微量加样器（北京百晶生物技术有限公司，WH861）；多功能酶标仪（美国分子仪器有限公司，SpectraMax®MS）；超声匀浆器（美国Sonics，VCX130）；实时荧光定量PCR 仪（Roche，Roche Light Cycler96 型）；激光扫描共聚焦显微镜（日本NIKON，C1SI）。

1.2 动物及分组

SPF 级SD 雄性健康大鼠60 只，体重（200±10）g，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，动物的饲养、管理和操作严格按照SPF 级大鼠的管理要求进行。动物许可证号：SCXK（京）2014-0004。动物实验方案已通过华北理工大学附属医院伦理委员会审核。采用随机数字表法将其分为假手术组、低灌注组、参芎组，每组各20 只，适应喂养7 d，术前禁食12 h。低灌注组与参芎组采用颈总动脉结扎建立脑缺血模型；40 mg/kg腹腔注射戊巴比妥钠使大鼠充分麻醉；仰卧位将大鼠四肢及牙齿固定，脱毛备皮消毒；颈部正中纵向切口切开皮肤，小心分离右侧颈总动脉，用鱼线结扎，冲洗伤口后缝合，每天消毒伤口，防止术后感染；假手术组只暴露颈总动脉不结扎[5-6]。参芎组每天腹腔注射参芎葡萄糖注射液24 mg/kg。低灌注组及假手术组腹腔注射等量生理盐水，共7 d。

1.3 样本的采集及处理

经腹腔麻醉后，大鼠仰卧位固定于操作台上，打开胸腔，暴露腹主动脉，一次性注射器采血7～9 ml，4℃，2000 r/min 离心10 min，分离血清后置于-80℃保存备用。消毒颈部皮肤，使用蝶形针穿刺枕骨大孔，待有落空感时见清亮脑脊液流出，将抽出的脑脊液注入预冷的EP 管中，-80℃保存。脑脊液收集结束后将大鼠断头取脑。手术器械分离大鼠侧脑室，提取脉络丛组织，随机取每组4 只大鼠的脉络丛放入装有4%多聚甲醛EP 管中固定，8 只大鼠的脉络丛放入装有Trizol 的EP 管中-80℃保存备用。

1.4 大鼠血清及脑脊液中白蛋白含量检测

测定前随机将各组8 只大鼠血清及脑脊液从冰箱取出在室温下平衡，ELISA 法检测血清白蛋白（serum albumin，SAlb）和脑脊液白蛋白（cerebrospinal fluid albumin，CAlb）含量，实验步骤严格按照试剂盒说明书进行，并计算脑脊液及血清白蛋白商值（QAlb=CAlb/SAlb）。

1.5 实时荧光定量PCR 检测脉络丛组织ZO-1 与Occludin 的mRNA

Trizol 提取总RNA，随后反转录合成cDNA 进行实时荧光定量PCR 扩增。PCR 条件：95℃下预变性，95℃变性10 s，60℃退火60 s、72℃延伸90 s，重复40 个循环，反应总体系为20 μl：Mix 10 μl，正反向引物各0.6 μl，cDNA 模板100 ng，ROX Reference Dye 0.4 μl，无酶双蒸水至20 μl。凝胶电泳鉴定，PCR 产物，本实验以GAPDH 为内参，实验重复3 次，每个样本均采用3 个复孔，所得结果采用2-ΔΔCt法进行计算。引物序列见表1。

表1 引物序列表

1.6 激光共聚焦方法检测脉络丛组织ZO-1 与Occludin 的荧光强度

将4 只大鼠的脉络丛组织迅速浸入4%多聚甲醛内固定；磷酸盐缓冲液漂洗5 min，重复3 次；在含1% Triton X-100 的磷酸盐缓冲液中通透20 min，磷酸盐缓冲液漂洗5 min，重复3 次；1%BSA（用磷酸盐缓冲液稀释）于室温下封闭1 h；倾去封闭液后按稀释比（1∶100）加入一抗，一抗稀释液为含1%BSA 的磷酸盐缓冲液，4℃孵育过夜，磷酸盐缓冲液漂洗5 min，重复3 次；随后滴加荧光素标记的二抗，二抗由磷酸盐缓冲液稀释（1∶200），37℃避光孵育1 h；漂洗后于激光扫描共聚焦显微镜下观察，488 nm 为激发波长，525 nm 为发射波长，物镜为1000 倍的显微镜。应用Image J 软件对获取的图像进行ZO-1 与Occludin 荧光强度分析，荧光强度值越大，蛋白表达越高。

1.7 统计学方法

采用SPSS 17.0 统计学软件对所得数据进行分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，组间比较采用t 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组大鼠SAlb、CAlb 及QAlb 比较

低灌注组CAlb、QAlb 高于假手术组，参芎组CAlb、QAlb 低于低灌注组，差异有统计学意义（P ＜0.05）；低灌注组与假手术组SAlb 比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）；参芎组与低灌注组SAlb 比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表2。

表2 三组大鼠CAlb、SAlb 及QAlb 比较（）

表2 三组大鼠CAlb、SAlb 及QAlb 比较（）

注：与假手术组比较，aP ＜0.05；与低灌注组比较，bP ＜0.05。CAlb：脑脊液白蛋白；SAlb：血清白蛋白；QAlb：脑脊液及血清白蛋白商值

2.2 三组脉络丛组织ZO-1 和Occludin mRNA 表达比较

低灌注组ZO-1、Occludin mRNA 水平低于假手术组，参芎组紧密连接蛋白ZO-1、Occludin mRNA 高于低灌注组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图1。

图1 三组脉络丛组织ZO-1 和Occludin mRNA 表达比较（n=8）

2.3 三组ZO-1 和Occludin 荧光强度比较

如图2～3 所示假手术组ZO-1、Occludin 荧光分布呈连续线状环形分布，荧光强度较强；低灌注组荧光强度减弱，光环连续性有缺损，荧光几近消失；参芎组ZO-1、Occludin 荧光强度增加，连续性相对完整。低灌注组ZO-1、Occludin 荧光强度低于假手术组，参芎组ZO-1、Occludin 荧光强度高于低灌注组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表3。

图2 三组ZO-1 荧光强度变化

图3 三组Occludin 荧光强度变化

表3 三组ZO-1 和Occludin 荧光强度比较（）

表3 三组ZO-1 和Occludin 荧光强度比较（）

注：与假手术组比较，aP ＜0.05；与低灌注组比较，bP ＜0.05

3 讨论

脉络丛作为血-脑脊液屏障的物质基础，对于维持神经中枢系统的平衡有重要作用。脉络丛可分泌脑脊液，而脑脊液对脑组织有支持、保护与营养作用，正常生理状态下，其成分保持相对稳定[7]。但是，在脑组织发生损伤或疾病时，脑脊液中的一些血源性蛋白分子，如白蛋白（albumin，Alb）的含量会发生变化。脑脊液中80%以上Alb 来自血液，而SAlb 含量一定程度上是稳定的，不受机体组织损伤或者炎症的影响。由于血-脑脊液屏障的存在，CAlb 含量甚微，当血-脑脊液屏障受到损伤，通透性增大时，Alb 会通过血-脑脊液屏障进入脑脊液中，导致CAlb 大幅度增加，因此QAlb可以作为反映血-脑脊液屏障通透性损伤的指标，且数值越大损伤越严重[8-10]。本研究结果显示，低灌注组CAlb、QAlb 高于假手术组（P ＜0.05），提示低灌注情况下损伤大鼠血-脑脊液屏障通透性，与魏微等[11]研究结果一致。参芎组CALB、QAlb 低于低灌注组（P ＜0.05），提示参芎葡萄糖注射液可改善大鼠血-脑脊液屏障通透性。

血-脑脊液屏障的紧密连接主要由Occludin、claudins、JAM，ZO、AJs 及细胞骨架蛋白构成，Occludin、claudins、JAM 属于跨膜蛋白，决定脉络丛上皮细胞的基本形态特征[11-13]。完整的紧密连接结构使相邻细胞紧密靠拢，组成环绕细胞的物理屏障，决定对物质的通透性。跨膜蛋白由细胞质支架蛋白组成，包括ZO-1和Occludin[14-15]。ZO-1 是首个被发现的紧密连接相关蛋白[16]。ZO-1 能够充当细胞内支架蛋白。有研究显示[17-19]，ZO-1 是屏障破坏的标志性蛋白，与血-脑脊液屏障损伤有密切关联。Occludin 是第一个被确定的紧密连接跨膜蛋白，被认为是最重要的、相对特征性强的紧密连接跨膜蛋白[20-21]。ZO-1 是Occludin 和细胞骨架蛋白的桥梁，与Occludin 相互作用调节紧密连接屏障，与血-脑脊液屏障通透性有紧密关系，ZO-1 与Occludin 蛋白下降与血管的通透性增加密切相关[22-27]。Wu 等[2]研究发现ZO-1 与Occludin 共同参与缺氧缺血诱导的血-脑脊液屏障通透性增加。这与本实验研究结果一致。本研究结果显示，低灌注组ZO-1、Occludin mRNA 及荧光强度低于假手术组（P ＜0.05），提示血-脑脊液屏障完整性遭到破坏，通透性增加。而参芎组ZO-1、Occludin 荧光强度高于低灌注组（P ＜0.05），提示参芎葡萄糖注射液可增加ZO-1 和Occludin mRNA 表达及分布，通透性降低，保护血-脑脊液屏障。

综上所述，低灌注状态引起的缺血可导致大鼠血-脑脊液屏障通透性增加，而参芎葡萄糖注射液可改善这一损伤，在一定程度上对血-脑脊液屏障有保护作用。本研究结果将为临床上低灌注相关疾病的预防和治疗提供理论依据。