新西兰家兔颈动脉体外应力培养研究

付海洋 李 敏,2 于 浩,2 付步芳 王召旭

1.中国食品药品检定研究院医疗器械检定所，北京 102629；2.烟台大学生命科学院，山东烟台 264000

近年来血管支架从材料到工艺都在不断优化发展，为了能够更好地评价这类医疗器械的性能，各种评价方法不断发展[1-4]。传统的动物实验是目前主要评价手段，但该类方法耗时长、影响因素过多。体外组织学评价具有细胞评价和动物评价不可替代的特点，比如其既可模拟动物体内的生理环境和流体力学环境，又可通过设置参数、添加试剂成分控制各种条件，以探究各种因素所产生的作用。但目前体外组织学评价研究受限于体外血管组织培养，发展缓慢，面临的难点主要是在保证无污染血管长期存活的基础上维持血管的组织结构和生理功能[5-8]。本研究主要旨在解决两个问题：一是如何实现长期无污染培养，二是研究应力对血管结构的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

成年健康新西兰家兔3 只，体重2.5～3.0 kg，SPF 级，性别不限，由中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所提供。实验动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0017 号，实验动物合格证号：NO.110317201100 0144，伦理号：中检动（福）第2019（A）054 号。

1.2 试剂

MEM 培养基（HyClone）；胎牛血清（Gibco）；青链霉素双抗溶液（Gibco）；Masson 染色试剂盒（Solarbio）；10%三氯化铁水溶液（上海铭博生物）；1%碘液（Solarbio）。

1.3 仪器

BOSE ElectroForce 5200 BioDynamic 生物反应器。

1.4 实验方法

1.4.1 分组 每只新西兰家兔取两侧颈动脉，各长8～10 cm，取2 cm 做静态培养对照，另外各取3～4 cm（其中2 cm 用于检测，两头多出部分用于固定）做25、50、80 ml/min 动态培养，每组重复3 次。以下简称静态组、25 组、50 组、80 组。

1.4.2 获取血管 获取家兔两侧颈动脉，用PBS 缓冲液轻柔冲洗2～3 次至无残留血液。

1.4.3 参数设置 如图1 所示组装生物反应器，箭头所示为液体流动方向，血管放置于反应舱内。模拟兔子的心跳频率调节脉动泵的位移频率为3 Hz/s；模拟兔子血管内的收缩压100 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），舒张压95 mmHg 调节脉冲泵的位移。调节蠕动泵，控制培养基流速分别为25、50、80 ml/min。

图1 生物反应器示意图

1.4.4 血管染色和观察 培养结束后用10%甲醛固定血管24 h 以上。制备切片行HE、EVG、Masson 染色，并用显微镜观察内外膜、弹性纤维、胶原纤维等。

2 结果

2.1 HE 染色

如图2A，静态组0 d 血管形态正常，内皮细胞完整，内弹力板整齐；图2B中静态组静态培养15 d 血管内皮细胞完整，平滑肌细胞排列混乱；图2C中80 组培养4 d 血管形态正常，内皮细胞不可见，平滑肌细胞排列混乱且松散，内弹力板清晰；图2D中80 组培养8 d 与4 d 比较，内侧平滑肌细胞排列由混乱变为整齐；图2E～F中50 组培养10、15 d 的血管形态相似，未见内皮细胞，平滑肌细胞排列整齐且细胞核为椭圆状，呈现增殖状态，内弹力板清晰。图2G～H中25 组培养10 d 和15 d 血管形态均正常，细胞排列整齐，内皮细胞完整，中膜内弹力板整齐。

2.2 EVG 染色

图2A静态组0 d 血管弹性纤维舒张且有序；图2B静态组静态培养15 d 血管中弹性纤维和0 d 比较收缩剧烈；图2C～D80 组培养4、8 d 血管弹性纤维未见明显变化；图2E和图2G50 组和25 组10 d 血管维持正常状态；图2F和图2H显示50 组和25 组培养15 d和14 d 的血管弹性纤维较10 d 明显疏松且趋于平直，且50 组条件下更为平直。

图2 染色结果（200×）（见内文第5 页）

2.3 Masson 染色

静态组0 d 胶原纤维均匀分布在整个血管中膜；静态组15 d 血管中胶原纤维分布范围与0 d 基本一致；80 组动态培养4 d 的血管胶原纤维分布及含量保持较好；80 组培养8 d 血管胶原纤维明显减少，红色肌纤维着色增多；50 组和25 组血管胶原纤维变化趋势与80 组相同，但速度慢。见图2。

3 讨论

本研究中的体外血管培养在生物反应器中进行，该装置包括血管培养仓、蠕动泵、脉动泵、储液瓶及监测装置。其复杂的结构，增加了操作的难度和污染的可能，其难点在于在保证无污染血管长期存活的基础上维持血管的组织结构和生理功能[9-10]。1995 年Nathalie Bardy 等设计了一种体外培养模型，加载不同的流量和流速，血管存活了8 d，但整体装置较为简单，不能模拟血流的周期性脉动[11]。2001 年，刘波等[12]设计了新型的血管体外应力培养系统，对血管施加定常流与脉动流，稳定培养猪颈总动脉7 d；2006 年，张海燕[13]为研究冠脉支架再狭窄的机制设计了血管体外培养装置，模拟了在体时血管内壁剪切力、收缩舒张压、流体层流等，可做到稳定培养7 d 左右；2012 年北京航空航天大学与四川大学联合研制了一种双循环生物反应器，分别调控剪切力、舒张压、收缩压的大小，施加定常流与脉动流，但稳定培养时间过短[14]；2019 年和2020 年Post 等[15]和Daum 等[16]分别运用生物反应器对组织工程血管进行了14 d 和7 d 的培养。综上体外血管组织的培养通常达到7 d，鲜有超过2 周的记录。本研究通过优化实验程序，改善实验条件，严格的无菌操作等，使得血管在体外动态培养的时间达到15 d，和目前国内外体外培养的最长时间基本一致。

血管管壁由三层膜构成，最内层为内膜，由平行排列的内皮组成；中膜由多层环形平滑肌纤维组成；外膜由纤维细胞，纵行的胶原纤维束和薄弹力纤维共同组成[17-18]。新西兰家兔的血液正常流速为25 ml/min[19]，为了研究高流速对血管结构的影响，本实验中动态组设了流速分别为50 ml/min 和80 ml/min 的50 组和80 组，流速加快会造成血管受到的剪切力增大，内皮细胞会变得更细长[20]。本研究中，动态组血管HE 染色切片中未见到明显内皮细胞，一方面可能是因为细胞变细长后未切到细胞核，另一方面可能是在取血管时的拉扯损伤了内皮细胞，或高应力环境导致内皮细胞易脱落。

血管平滑肌细胞的主要功能是调节血管的口径、保持血管支撑力，正常应力下保持排列整齐且细胞核为长梭型[21]。静态组静态培养15 d 由于血管失去应力环境导致血管平滑肌细胞生长方向变得混乱；应力突然增加导致80 组4 d 平滑肌细胞排列发生变化，但8 d时血管逐渐适应了新的应力环境，从外侧细胞开始逐渐恢复整齐；50 组出现细胞增殖的情况，可能的原因是内皮细胞受损后，切应力直接作用于平滑肌细胞，引起了细胞增殖与凋亡的失衡[22-23]；25 组内皮细胞和平滑肌细胞基本维持正常状态。

弹性纤维是血管的主要功能成分，对维持血管弹性回缩起着重要作用[24]。正常血管的弹力纤维形状清晰，呈疏松的波浪状有序排列。静态组血管在离体后失去了在体时的压力、应力、载荷等，随着培养时间的增长，血管发生收缩形变，弹性纤维与刚取出时比较呈现收缩状态。动态组固定时保持了在体长度，维持体内应力环境，不同流速下弹性纤维的形态基本保持不变，均排列有序，提示本实验中施加的应力尚在弹性纤维的承受能力范围内。

胶原纤维为血管提供一定的刚度及强度，与弹性纤维共同维持血管壁的力学功能[25]。胶原纤维的弹性模量比弹性纤维和平滑肌高，是力的主要承担者。静态组血管未受到力的刺激，胶原纤维没有流失；而动态组血管处于应力的环境中，胶原纤维承受力的同时也在慢慢降解，由于离体培养时没有添加合成胶原纤维的成分，故在培养到15 d 时，胶原纤维降解最为严重，呈细丝状；不同流速的条件下，80 组在培养8 d 时已经能够看出胶原纤维呈细丝状，而50 组在15 d 时呈现相同状态；由此可见，应力越高，胶原纤维降解的速度越快。

本研究在应力条件下体外培养血管15 d，和目前国内外体外培养的最长时间基本一致[25]。结果显示，在模拟动物体内各参数的条件下，血管体外动态培养有助于维持血管的生理结构，但高应力条件下，会导致血管内皮细胞受损，进而造成平滑肌细胞增殖，胶原纤维流失较为严重。今后的研究工作应重点关注防污染，延长培养时间；培养过程中及时补充胶原，防止胶原蛋白流失。