增强采样副本交换分子动力学研究端基对Tau74蛋白结构特征的影响

石虎，姚泽帅

（山西大学 化学化工学院，山西 太原，030006）

0 引言

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD），又名老年痴呆症，是一种常见的神经退行性疾病［1］。临床上有两种表现：（1）细胞外的淀粉样斑块沉积，其主要成分为 β-淀粉样蛋白［2-3］；（2）细胞内纤维状缠结，其主要成分为Tau蛋白［4-5］。Tau蛋白属于微管相关蛋白家族。它们主要在神经元中表达。在微管蛋白单体组装成微管构成神经元微管网络中起重要的作用。AD患者神经细胞中，Tau蛋白发生聚集是导致神经细胞萎缩和死亡的主要原因［6］。因此，要理解Tau蛋白的聚集过程就需要探索Tau蛋白的结构性质。

与微管结合的Tau蛋白是本质无序蛋白，同时具有很好的可溶性，其在人体中枢神经系统中大量存在［7］。Tau的结构如示意图1A所示，包含N端、酸性区、脯氨酸富集区域、重复（Repeat）区域和C端。在全长的Tau蛋白中，N末端和C末端都是高度无序结构［8］。Repeat区域是整个Tau蛋白中最关键的区域，其原因在于repeat结构特征不但与tau蛋白-微观结合相关，而且与致病纤维状聚集有关［9-12］。对于纤维聚集体的实验研究显示，Tau聚集体的β-sheet核心也就集中在repeat区域［13-14］。

Repeat区域分为R1、R2、R3和R4四个区域，其中R2区域也可以出现缺失状态。现有的研究表明，repeat区域的结构特征也趋向于自由卷曲状态［15-17］。作者Huan He独立的R1～R4的单体模拟研究显示：R1、R2和R4取向螺旋结构，而R3则倾向于折叠结构［18］。二级结构的结构特征如示意图1B所示。LI对R3在不同组氨酸异构条件下的模拟结果显示：R3片端为非集中结构特征，其聚类最高值在 2.4%（εε）、10.8%（εδ）、1.0%（δε）和 10.6%（δδ）［19］。模拟结果上的差异可能来源于对端基处理的不同，因此，本论文将选取Tau蛋白尿片段并探索其在不同端基条件下的结构性质差异。为了更好地排除片段中N末端和C末端的影响，我们选择的Tau片段从R1的末端开始延伸到R4的N末端。

示意图1 Tau蛋白的结构以及Tau74序列（A）；α-helix、parallel β-sheet和 antiparallel β-sheet的二级结构特征（B）Scheme 1 The structure of Tau protein and the residual sequence of Tau74 fragment（A）.The secondary structure of α-helix，parallel β-sheet，and antiparallel β-sheet（B）

1 模拟方法

本文使用副本交换分子动力学（replica-exchange molecular dynamics，REMD）对 Tau74和Tau74c蛋白片段进行增强采样分子动力学模拟。REMD是一种增强采样的分子动力学模拟方法。其模拟过程中会设定多个副本对应着由低到高的多个温度。在模拟过程中，副本之间可以发生一定概率的结构交换。因此，此方法有助于系统跨越势能面中的局域最小值。

模拟过程中，Tau74和Tau74c初始结构为线型的氨基酸长链，REMD模拟使用了Amber 18软件、ff14SBonlysc力场和隐形水模型［20］。模拟过程中使用了SHAKE和Particle mesh Ewald设置。本文中，每个REMD模拟共设定了10副本，对应温度范围为310 K～510 K。模拟时间步长为2 fs，并设定副本之间每4 ps交换一次。每组体系一共进行了700 ns的REMD模拟。本文中，REMD的交换概率约为10.0%～10.4%，整个模拟过程中最低副本对应温度极限的往返次数为5～6次，验证了本文REMD采样的合理性。

2 结果与讨论

2.1 判断REMD模拟平衡

为了判断REMD的平衡，首先统计了不同时间尺度上的聚类特征，从图1所示：Tau74（图1A，图2A）体系在300 ns～500 ns与500 ns～700 ns所对应的聚类分布趋势一致，可以判定，此时Tau74已经处于动力学平衡阶段。因此，后续的结构特征分析仅使用300 ns～700 ns所对应平衡的400 ns轨迹。同理，Tau74c体系（图1B，图2A）在300 ns～500 ns与500 ns～700 ns所对应的聚类分布趋势也保持一致，仅使用最后平衡的400 ns轨迹用于下文中的结构分析。

图1 不同时间尺度上Tau74（A）和Tau74c（B）的聚类特征Fig.1 Different time scale for Tau74（A）and Tau74c（B）fragments on cluster properties

2.2 Tau74和Tau74c蛋白的二级结构特征

为了评估Tau74和Tau74c的结构特征，蛋白质二级结构分析结果如图2BCD所示，Tau74和Tau74c体系中都几乎没有平行β-sheet结构的产生（图2B），而反平行β-sheet却存在着巨大的差异，在Tau74体系中，β-sheet结构出现在G9-S25（35.9%～99.3%）、G28-P37（35.6%～84.3%）、G39-P48（18.1%～99.4%）和 L61-P68（12.7%～79.7%）四个区域。而在Tau74c体系中，β-sheet结构出现在G8-L18（32.5%～97.5%）、D31-P37（22.8%～57.1%）、G40-D50（22.1%～76.3%）、T55-L61（33.7%～62.3%）和 I64-H66（22.4%～41.5%）五个区域（图2C）。其差异性集中表现在D19-Q24和T55-L61两个区域，在Tau74c体系中N15-S25具有稍高的α-helix含量，而Tau74中，αhelix结构稳定在P48-C58（7.3%～51.2%）区域（图2D）。二级结构分析的结果显示，通过乙酰基（acety group，ACE）和甲胺基（N-methylamide，NME）保护后的Tau74c片段和无保护Tau74片段的二级结构特征存在巨大的差异。也就是说，端基在Tau74/Tau74c片段的折叠过程中发挥着非常重要的作用。

图2 Tau74和Tau74c的结构（A）及其对应的平行β-sheet（B）、反平行β-sheet（C）和α-helix（D）的特征Fig.2 Modeling structures of Tau74 and Tau74c（A）and characters of corresponding parallel β-sheet（B），antiparallel β-sheet（C），and α-helix（D）properties in each system

2.3 Tau74和Tau74c蛋白的聚类结构特征

为了进一步探索空间结构特征的稳定性，我们使用聚类分析程序对400 ns稳定的轨迹进行结构聚类。聚类标准选用alpha-C原子。结果显示，Tau74和Tau74c两个体系都表现出非集中的结构特征，此结果与平衡判断的结果相一致，也反映出了Tau是本质无序蛋白的特征［15-17］。

然而，在Tau74含量最高的五个聚类结构特征可以看出，sheet区域（图3绿色区域）基本保持不变，而N端（蓝色小球）和C端的变化范围却非常大。其端基局域结构的变化引起了聚类分析中非集中结构特征的出现。由此可见，N端和C端所处的环境将非常容易引起Tau蛋白的结构变化。考虑到Tau74蛋白是处于Tau整体中的一个局域片段。因此，选择ACE和NME端基保护Tau蛋白片段至关重要，否则非保护策略下端基的行为将严重影响了Tau74蛋白原本的结构性质。由此可见，Tau蛋白模拟过程中应选取端基保护策略，其直接影响着模拟结果的正确性。

图3 Tau74与Tau74c的前五种聚类结构特征与对应的含量Fig.3 Most abundant five conformational states by cluster analysis and their probability distributions

2.4 Tau74和Tau74c蛋白的氨基酸接触特征

为了进一步的探索Tau74和Tau74c两者之间的氨基酸相互作用规律，基于alpha-C计算得到的氨基酸接触图如图4所示。在Tau74体系中（图4A）一个稳定的反平行β-sheet结构出现在G38-Y46与G8-K16位置。此结果表明，虽然Tau74蛋白在聚类分析中无法保持一种集中的结构行为，但是β-strand G38-Y46片段与β-strand G8-K16片段之间的β-strand相互作用非常稳定。相比之下，Tau74c体系中（图4B），没有任何β-strand结构出现。此结果进一步验证了端基对Tau74/Tau74c蛋白的结构稳定性影响非常大。在含有端基（ACE和NME）保护的条件下，相比于稳定Tau74中规律的相互作用特征，Tau74c表现为自由柔性多变的结构特征。

图4 Tau74和Tau74c的氨基酸接触图Fig.4 Contact map of Tau74 and Tau74c fragments

3 结论

本文针对神经纤维状缠结中Tau蛋白，使用REMD模拟方法研究了Tau74和Tau74c的结构特征。二级结构分析表明Tau74和Tau74c两者的结构存在巨大的差异，特别是D19-Q24和T55-L61两个区域，在Tau74c体系中N15-S25具有稍高的αhelix含量，而Tau74中，α-helix结构稳定在P48-C58（7.3%～51.2%）区域。聚类的结果显示Tau74和Tau74c两者都表现出本质无序的结构行为，其主要原因在于端基区域的自由变化掩盖了结构细节。深层的分析证明了Tau74中存在着稳定的β-strand G38-Y46片段与β-strand G8-K16片段之间的βstrand相互作用，而Tau74c仅表现为自由柔性结构特征。本论文结果论证了Tau蛋白模拟过程中应选取端基保护策略，此将直接影响着模拟结果的正确性。