重庆地区眉溪小车轮虫及其与近缘种的比较

夏 萍 唐发辉 赵元莙

(重庆师范大学生命科学学院, 重庆市动物生物学重点实验室, 重庆 401331)

车轮虫是一类危害性外寄生纤毛虫, 常寄生于海、淡水鱼类、部分贝类及极少数的腔肠动物; 当感染强度较大时, 可能引发宿主鳃呼吸功能障碍等,极其严重时可导致宿主死亡[1—3]。目前车轮虫主要的研究工作大多数仍聚焦于形态分类学方面[4,5]。根据Lynn[6]纤毛虫分类系统, 车轮虫科Trichodinidae包括车轮虫属Trichodina、三分虫属Tripartiella和小车轮虫属Trichodinella等10个属, 其中小车轮虫属因其个体微小且同一物种的不同种群之间齿体差异较大而颇受争议。

眉溪小车轮虫Trichodinella myakkae(Mueller,1937) Šrámek-HuŠek, 1953隶属于小车轮虫属, 由Mueller于1937年在美国佛罗里达州的大口黑鲈Aplites salmoides上首次检获并描述[7—9], 后在小口牛胭脂鱼Ictiobus bubalus和草鱼Ctenopharyngodonidellus等宿主上均有发现[10,11], 但迄今均未见任何可供参考的附着盘银染资料 (车轮虫形态学物种鉴定的重要依据); 由于常与其他车轮虫混合感染宿主鱼, 且形态量度也难以与小车轮虫属其他物种相区分, 故难以对其进行种类鉴定。眉溪小车轮虫与周丛小车轮虫Trichodinella epizootica(Raabe, 1950)Šrámek-HuŠek, 1953和纤细小车轮虫Trichodinella subtili(Lom, 1959) Lom & Haldar, 1977形态相似,有研究认为眉溪小车轮虫是周丛小车轮虫或纤细小车轮虫的同物异名[11—13]。随着分子技术在车轮虫领域的应用, 车轮虫的研究得到进一步发展。2006年Gong等[14]提交了眉溪小车轮虫的18S rDNA序列 (AY102176), 但由于未提供分子数据对应的原始银染标本, 该序列的有效性仍有待进一步核实[15,16]。为此, 本文基于新获得的寄生于多种宿主的小车轮虫形态学和分子数据, 描述了眉溪小车轮虫的形态和分子特征, 并进行了系统发育分析。

1 材料与方法

1.1 采集与鉴定

宿主鱼鲢Hypophthalmichthys molitrix和鳙Aristichthys nobilis于2019年6月采自重庆江津区同一养殖渔场 (29°18′N, 106°16′E), 宿主鱼麦穗鱼Pseudorasbora parva于2019年8月采自重庆沙坪坝区(29°52′N, 106°44′E), 且上述宿主鱼均处于幼鱼期(体长约8—13 cm)。活体宿主鱼带回实验室解剖后, 使用体视显微镜 (NIKON SMZ1500) 进行车轮虫的活体观察, 并进行鳃涂片, 待自然空干后采用修订版干银法对鳃组织涂片进行附着盘的形态学染色[17]。利用全自动光学显微镜 (LEICA DM6000B)进行车轮虫附着盘的显微照片拍摄。采用“统一特定方法”对所获车轮虫样本进行形态学数据的测量与统计[18]。齿体定位线条图利用软件CorelDRAW X8绘图完成。根据Van As和Basson提出, 唐发辉等[19,20]完善的方法进行齿体特征的描述。

1.2 主成分分析

使用PAST 3软件对眉溪小车轮虫各株系虫体直径、附着盘直径、缘膜宽、齿环直径、齿体纵长、齿长、齿钩长、齿锥宽、齿棘长、辐线数及齿体数11项形态学特征进行主成分分析 (PCA), 利用变异协方差矩阵生成置信度为95.0%的散点图。

1.3 DNA提取、扩增与测序

在光学显微镜下使用玻璃微吸管吸取单只车轮虫, 无菌水洗涤纯化后采用试剂盒提取DNA(REDExtract-N-AmpTMTissue PCR Kit), -20℃冻存。PCR体系: 2×TaqPCR预混液 (2×TaqMaster Mix, Novoprotein, E005-02B) 6.25 μL, 引物各0.5 μL,模板DNA 2 μL, 超纯水补足至25 μL体系。PCR反应程序为94℃预变性1min 30s; 94℃变性20s, 56℃退火20s, 72℃延伸2min, 35个循环; 72℃再延伸5min。18S rDNA的扩增引物为: 82F (5′-GAAACTG GGAATGGCTC-3′) 和LSUR (5′-GTTAGTTTCTT TTCCTCCGC-3′)[21]; ITS-5.8S rDNA的扩增引物为:ERIB10-V (5′-CCGTAGGTGAACCTGCGGAAG-3′) 和28S1R (5′-GTGTTTCAAGACGGGTCG-3′)[22]。扩增产物直接送至英潍捷基生物科技有限公司进行测序。

1.4 分子特征分析

在GenBank数据库中进行序列的同源性比对;应用DAMBE7.2.136软件分析碱基替代饱和性; 采用MEGA6.0进行遗传距离 (K-2-P模型)的计算及序列变异位点的分析; 使用BioEdit7.0.5.3进行18S rDNA的GC含量计算; 18S rRNA二级结构的预测基于RNA structure5.2完成, 所有参数均设置为默认,选取自由能最低的模型并利用RNAViz2.0参照European Ribosomal RNA Database手动调整完成[23]。

1.5 系统进化分析

共选取63条序列使用BI (Bayesian Inference)及ML (Maximum Likelihood) 构建18S rDNA系统发育树, 序列包括眉溪小车轮虫三株系共5条18S rDNA序列, 及在GenBank数据库中选取的同源性较高的分子序列, 其余序列参照文献[24]进行选取,外群选取大肾形虫Colpoda magna(EU039896)与毛板壳虫Coleps hirtus(AM292311)。采用GTR+I+G模型在MrBayes3.1.2软件中构建BI树, 运行300万代, 每200代抽样1次, 舍弃前25.0%样本。通过在线工具The CIPRES Science Gateway V.3.3 (http://www.phylo.org/), 在RAxML-HPC2 XSEDE (8.2.12) 下构建ML树[25,26], 使用GTR+G模型进行1000次自举(Bootstrap) 重复检测。利用FigTree v1.4.2显示系统发育树的拓扑结构, 使用Photoshop CS3美化树图。同理, 在GenBank数据库中选取鲢、鳙、草鱼及麦穗鱼线粒体16S rDNA序列各2条, 以奇额墨头鱼Garra mirofrontis(GU168764) 为外群构建宿主鱼的BI树。

2 结果

2.1 形态学描述

株系1: 眉溪小车轮虫Trichodinella myakkae(HM; 图 1A和表 1)

图1 眉溪小车轮虫附着盘的银染显微结构图及齿体定位图 (本研究)Fig. 1 Photomicrographs of silver impregnated specimen and denticle diagrammatic drawings of T. myakkae

采集地: 重庆江津区

采集时间: 2019年6月

宿主及寄生部位: 鲢; 鳃表

感染率: 100% (15/15)

感染强度: 中度 (车轮虫感染强度的划分标准:光学显微镜下放大10×10倍后1个视野内平均虫体数为0—5为轻度; 虫体数5—10为中度; 虫体数＞10为重度, 后同)。

形态学描述 (n=13): 该种虫体小型, 虫体直径(19.8±1.1) μm (17.2—21.9 μm), 附着盘直径(16.5±1.2) μm (14.5—18.1 μm), 齿环直径(8.1±0.6) μm(7.3—9.9 μm), 缘膜宽(1.8±0.5) μm (1.2—2.9 μm)。染色后附着盘齿体形态清晰, 无明显的中央颗粒;齿钩部分发达, 略成长方形, 齿钩长(3.4±0.3) μm(2.9—3.9 μm); 齿钩前缘超过Y+1轴, 前后缘稍弯曲, 多数齿钩外切缘略高于钝圆的骨突, 存在钩突且钩突较为发达, 无明显后突起, 齿钩连接纤细; 齿锥较发达, 齿锥宽(0.8±0.2) μm (0.4—1.1 μm), 齿锥顶点钝圆略超Y轴; 齿棘短且纤细, 齿棘长(1.0±0.3) μm(0.7—1.5 μm), 齿棘后倾斜不及Y轴与Y-1轴距离的一半, 无明显棘突; 口围绕度190°—210°。

株系2: 眉溪小车轮虫Trichodinella myakkae(AN; 图 1B和表 1)

表1 眉溪小车轮虫三株系、纤细小车轮虫及周丛小车轮虫形态学特征统计 (测量单位: μm)Tab. 1 Morphological characteristics of three strains of T. myakkae, T. subtilis and T. epizootica (measurement unit: μm)

采集地: 重庆江津区

采集时间: 2019年6月

宿主及寄生部位: 鳙; 鳃表

感染率: 100% (18/18)

感染强度: 中度

形态学描述 (n=15): 小型淡水车轮虫, 齿体形态与T. myakkae(HM) 株系相比, 本株系齿钩外切缘不圆滑, 这可能与染色时间相关, 但多数仍高于骨突; 齿钩前后缘平滑, 钩突显著且略为尖锐, 无明显后突起, 钩突与上个齿体形成的凹口嵌合较为紧密。形态学测量数据详见表 1。

株系3: 眉溪小车轮虫Trichodinella myakkae(PP; 图 1C和表 1)

采集地: 重庆沙坪坝区

采集时间: 2019年8月

宿主及寄生部位: 麦穗鱼; 鳃表

感染率: 38.4% (4/11)

感染强度: 轻度

形态学描述 (n=15): 虫体小型与其他株系相比, 本株系齿钩更为发达, 整个齿钩几近填满Y轴与Y+1轴间的空间; 该种具有较为光滑的齿钩前后缘,且其齿钩外切缘向上凸, 高于钝圆骨突; 齿钩连接较其他株系更为纤细, 钩突更为发达, 钩突向前与上个齿体形成的凹口嵌合疏松, 齿棘短但并不尖锐。形态学测量数据详见表 1。

2.2 眉溪小车轮虫三株系的主成分分析

主成分分析结果显示本研究获得的眉溪小车轮虫3个株系的形态学特征 (虫体直径、附着盘直径、缘膜宽、齿环直径、齿体纵长、齿长、齿钩长、齿锥宽、齿棘长、辐线数及齿体数) 构建的散点图高度重叠 (图 2)。

图2 眉溪小车轮虫三株系形态特征主成分分析Fig. 2 Principal component analysis of morphometric data of three strains of T. myakkae

2.3 18S rDNA与ITS-5.8S rDNA分子特征

本研究已测定并提交于GenBank的眉溪小车轮虫相关DNA序列信息详见表 2。眉溪小车轮虫3个株系均与T. myakkae(AY102176) 最相似 (相似度≥99.0%)。18S rDNA序列相似度及遗传距离显示, 3个株系间的序列相似度为99.2%—100%, 遗传距离为0.000—0.003。其中,T. myakkae(HM)与T.myakkae(AY102176) 之间序列相似度为99.6%, 遗传距离为0.003;T. myakkae (AN)与T. myakkae(AY102176) 之间序列相似度为99.6%, 遗传距离为0.003;T. myakkae(PP)与T. myakkae(AY102176) 之间序列相似度为99.6%, 遗传距离为0.004。眉溪小车轮虫各序列与T. epizootica(GU906246)的序列相似度为96.7%—97.7%, 遗传距离为0.017—0.021。GC含量显示本研究所获3株系及T. myakkae(AY 102176) 为50.8%—51.2%。

表2 眉溪小车轮虫三株系18S rDNA和ITS-5.8S rDNA序列登录号Tab. 2 Accession numbers of 18S rDNA and ITS-5.8S rDNA sequences of three strains of T. myakkae

18S rDNA与ITS-5.8S rDNA变异位点显示: 以T. myakkae(AY102176) 为参考序列,T. myakkae(HM)与T. myakkae(AN) 株系18S rDNA的相同变异位点共有7个, 且T. myakkae(HM) 在第34位也存在变异位点;T. myakkae(PP) 有7个变异位点。ITS-5.8S rDNA序列变异位点显示, 以T. myakkae(HM)为参考序列,T. myakkae(AN) 无变异位点, 而T.myakkae(PP) 存在18个变异位点 (图 3)。本研究所获眉溪小车轮虫3株系及T. myakkae(AY102176)的18S rDNA碱基组成频数显示平均转换频数为3, 颠换为1, 转换高于颠换, 转换率与颠换率之比R=2.28(＞2.0); 密码子第1、2、3位点转换及颠换频数如表 3所示, 其中第2位点最为保守, 无碱基替换，故R值不可计算。18S rDNA基因碱基替换饱和曲线如图 4所示, 转换遗传距离(S)大于颠换遗传距离(V), 且其增加速度也大于后者; 转换遗传距离(S)整体呈线性上升趋势, 而颠换遗传距离(V)则趋于稳定。各碱基替换饱和度情况显示, 替换饱和指数ISS(Index of Substitution Saturation) 小于替换饱和指数临界值ISS.c (the critical ISS value), 且P=0.0000 (差异极显著)。

图4 眉溪小车轮虫18S rRNA碱基替换饱和曲线Fig. 4 Base substitution saturation curve of 18S rRNA sequence of T. myakkae

表3 眉溪小车轮虫各株系18S rDNA碱基对数组成频数Tab. 3 Base pairs composition frequency of T. myakkae based on 18S rDNA

图3 眉溪小车轮虫三株系ITS-5.8S rDNA序列变异位点比较Fig. 3 Comparison of variation sites among three strains of T. myakkae based on ITS-5.8S rDNA sequences

所获眉溪小车轮虫3株系及T. myakkae(AY102176)的4个高变区 (V3、V4、V5和V7) 二级结构预测结果显示: 4个株系在4个高变区二级结构构型相同,仅在V3、V4和V5区一级结构存在碱基差异;T.myakkae(HM)与T. epizootica(GU906246)的二级结构显示: 眉溪小车轮虫与周丛小车轮虫在螺旋H17(V3区) 存在构型差异, 前者在螺旋H17仅有一个侧凸和大发卡环, 而周丛小车轮虫具有两个侧凸和小发卡环 (图 5)。

图5 眉溪小车轮虫 (HM)与周丛小车轮虫 (GU906246) 18S rRNA二级结构 H17区比较Fig. 5 Comparison of H17 regions for T. myakkae (HM) and T.epizootica (GU906246) based on 18S rRNA secondary structure

2.4 系统发育分析

基于18S rDNA构建的ML和BI树呈现出一致的拓扑结构 (本文只呈现BI树, 图 6A)。本研究的3个株系与T. myakkae(AY102176) 聚为一枝 (Clade A), 且位于系统发育树的顶部, 具有高支持率。Clade A中, 宿主为鲢的T. myakkae(HM1) 和T.myakkae(HM2) 及宿主为鳙的T. myakkae(AN1) 和T. myakkae(AN2) 分别聚枝后再形成姐妹枝, 后与宿主为草鱼的T. myakkae(AY102176) 聚枝后再与宿主为麦穗鱼的T. myakkae(PP) 聚枝。Clade A与小车轮虫未定种Trichodinellasp. (JQ663869) 聚为一枝后再与由周丛小车轮虫构成的支系Clade B互为姐妹枝, 并具有高支持率。基于线粒体16S rDNA构建的具有高支持率的鱼类系统发育树显示, 鲢枝、鳙枝先聚为一小枝后再与草鱼枝互为姐妹枝,最后再与麦穗鱼枝聚枝(图 6B)。

图6 基于BI法与ML法构建的分子系统发育树Fig. 6 Molecular phylogenetic tree constructed by BI and ML method

3 讨论

3.1 眉溪小车轮虫的种类鉴定及与近缘种的比较

口围绕度为车轮虫口面区口围带盘绕程度, 是车轮虫科中属间分类的重要依据, 本研究所获虫种口围绕度落入了小车轮虫属180°—270°的范围[27—29];附着盘银染标本显示该种具有小车轮虫属较直的齿钩、纤细的齿锥和短小的齿棘等典型特征[28,30];遗传距离和序列相似度显示: 本物种与周丛小车轮虫属于种间水平; GC含量均超过50.0%, 符合Tang和Zhao[31]所总结的小车轮虫属GC含量区间; 基于18S rDNA构建的系统发育树同样显示: 本研究所获物种与周丛小车轮虫及小车轮虫未定种聚为小车轮虫枝系。综合上述形态学、分子特征及系统发育分析表明本研究所获物种应隶属于小车轮虫属。Mueller[32]在1937年报道眉溪小车轮虫时, 国际无统一的形态学描述方法, 因此原始株系描述并不完善且缺乏附着盘银染图, 但基于已有的原始形态学特征描述显示: 本研究所获物种除具有齿棘外,其辐线数、齿体数目和虫体大小等鉴别性特征均与眉溪小车轮虫原始株系一致, 且本研究物种齿钩较直, 有明显的突起等特征也与之相符[5]。综上, 本研究所获物种应为眉溪小车轮虫, 并且本研究中的宿主鱼——麦穗鱼为眉溪小车轮虫的宿主新记录。

本研究所涉眉溪小车轮虫,与近缘种周丛小车轮虫、纤细小车轮虫形态比较相似, 但眉溪小车轮虫的虫体直径、附着盘直径、齿环直径、齿长和齿锥宽等形态特征均小于周丛小车轮虫及纤细小车轮虫, 且齿体数区间并不重合。结合齿体定位图分析, 眉溪小车轮虫纤细较直的齿棘与周丛小车轮虫弯钩状齿棘不同; 眉溪小车轮虫仅具有1个前突起, 区别于纤细小车轮虫具向前的2个突起 (钩突与齿锥前突起) 这一鉴别性特征[33]; 同时, 眉溪小车轮虫的口围绕度 (190°—210°) 也大于纤细小车轮虫(170°—190°) 及周丛小车轮虫 (180°—190°)的口围绕度[10,11,33,34], 故基于形态学分析表明: 眉溪小车轮虫与周丛小车轮虫及纤细小车轮虫应为不同物种。18S rDNA构建的系统树显示, 眉溪小车轮虫与周丛小车轮虫单独聚枝, 且两者二级结构在螺旋H17存在明显的构型差异 (眉溪小车轮虫仅有一个侧凸并有大的发卡环, 图 5), 表明本研究所获物种与周丛小车轮虫具有种间水平的差异。

3.2 眉溪小车轮虫的种内分化及其与宿主的协同进化

形态学研究表明, 本研究中的眉溪小车轮虫3个株系形态特征相似 (表 1), 附着盘齿体形态无明显差异 (图 1), 且主成分分析显示3个株系形态学测量数据所形成的散点图高度重叠 (图 2), 综合形态学与主成分分析结果表明眉溪小车轮虫各株系均属同种, 且无明显表型分化。眉溪小车轮虫各株系18S rDNA序列相似度为99.2%—100%, 遗传距离为0.000—0.004。以往的研究表明, 18S rDNA不同分类群遗传距离阈值种内水平为0.000—0.005[31], 表明3株系在分子层面产生分化, 但属于种内水平。T. myakkae(HM)与T. myakkae(AN) 18S rDNA和ITS rDNA序列变异位点几乎一致, 而T. myakkae(PP) 则产生了分子分化 (图 3)。有研究认为DNA的碱基替换记载着物种进化的信息, 且转换更易于饱和[35]。本研究显示眉溪小车轮虫各序列差异度与遗传距离呈线性关系, 转换大于颠换 (图 4), 表明眉溪小车轮虫各株系种间的进化潜能较大, 且受进化噪音的影响较小, 其转换和颠换均具系统发育研究意义。结合DNA序列碱基组成及相关资料分析(表 3), 碱基发生转换的可能易于颠换; 密码子第2位点较为保守, 且不同位点的碱基替换率不同, 但多表现为同义突变, 推测这些同义突变受到的自然选择压力较小, 突变后容易固定[36—38]。眉溪小车轮虫不同株系18S rRNA的二级结构构型一致, 进一步表明本研究所获3株系均属同种。

18S rDNA的系统发育分析显示(图 6): 宿主为鲢的T. myakkae(HM) 枝与宿主为鳙的T. myakkae(AN) 枝互为姐妹枝, 再依次与宿主为草鱼的T.myakkae(AY102176) 及宿主为麦穗鱼的T. myakkae(PP) 聚枝, 再次支持其为同种。各株系的宿主均属鲤科鱼类, 其中鲢和鳙隶属于鲢亚科Hypophthalmichthyinae, 草鱼隶属于雅罗鱼亚科Leuciscinae, 麦穗鱼隶属于亚科Gobioninae, 且基于线粒体16S rDNA构建的宿主鱼系统发育树显示(图 6B): 鲢亚科的鲢和鳙与雅罗鱼亚科的草鱼有较近的亲缘关系,亚科的麦穗鱼则与鲢亚科和雅罗鱼亚科较远,与已有研究结果一致[39,40]。本研究所揭示的眉溪小车轮虫的系统发育关系显示其与宿主鱼具有相同的进化趋势, 表明二者之间可能存在共物种形成的协同进化关系, 故在一定程度上宿主也可能成为影响眉溪小车轮虫演化的重要因素。但受限于本研究眉溪小车轮虫样本量较少, 且涉及宿主鱼多样性较为局限, 因此来自更多宿主的相关数据的获取可能更有利于厘清其中的自然关系。

基于上述分析结果,T. myakkae(HM、AN)与T. myakkae(AY102176) 株系差异较小, 而T. myakkae(PP)与其他株系已经出现差异, 但综合形态学特征、DNA序列分子特征 (序列相似度、遗传距离、变异位点及二级结构) 和分子系统发育分析的结果, 此类分化应属于种内水平, 推测部分眉溪小车轮虫在适应其不同宿主内的寄生生活过程中, 可能由于基因交流的减少而产生了种内多样性。系统发育分析还显示了眉溪小车轮虫与其宿主可能存在协同进化关系。