黄颡鱼母本的肠系膜脂肪沉积对繁育性能的影响

胡伟华 熊 阳 郭稳杰 王宇宏 朱晓鸣 梅 洁

(1. 华中农业大学水产学院, 武汉 430070; 2. 中国科学院水生生物研究所, 武汉 430072)

黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidracoRichardson)是我国一种重要的淡水经济鱼类, 育种技术的创新和新品种的培育推动了黄颡鱼产业的快速发展[1—5]。随着黄颡鱼“全雄1号”[6,7]和杂交黄颡鱼“黄优1号”[8]等水产新品种的推广, 黄颡鱼的养殖产量呈现持续增长, 从2010年的18.43×107kg增长到2019年的53.69×107kg[9]。

近年来, 随着黄颡鱼产业的不断发展, 对苗种质量要求也越来越高, 而苗种的好坏与母本的质量紧密相关。目前黄颡鱼生产过程中所使用的母本非常混杂, 没有经过系统的选育和培育。由于普通黄颡鱼经济效益低, 养殖户多去养全雄或者杂交黄颡鱼, 导致雌鱼缺乏; 少数企业根据黄颡鱼雌雄生长差异的现象, 把过筛所得的小的个体作为母本进行培育, 但其中混杂了20%—30%的雄性黄颡鱼, 不仅浪费了亲本培育饲料, 而且将生长快个体较大的母本过筛掉。杨天毅等[10]和Xiong等[11]利用鱼类性逆转技术结合黄颡鱼性别连锁分子标记成功将XX雌性黄颡鱼逆转为XX雄性黄颡鱼, 然后XX雄性和雌性黄颡鱼繁殖后获得黄颡鱼全雌配套系。黄颡鱼全雌配套系还需要一个完善的母本培育模式进一步提升其繁殖性能, 充分发挥其作用, 实现黄颡鱼“全雄1号”和杂交黄颡鱼“黄优1号”新品种的改良。

杂食性和肉食性鱼类对碳水化合物利用率较低, 对脂肪消化率较高, 因此在杂食性和肉食性鱼类饲料中, 脂肪常作为重要的能源物质。同时, 脂肪是鱼类必需脂肪酸的主要来源, 也是细胞的组成成分和代谢中不可缺少的物质[12,13]。适宜的脂肪水平和均衡的脂肪酸组成对维持鱼类的生长、发育和繁殖起着重要的作用[14]。已有关于黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachelli)的研究中, 蛋白质、脂肪和糖类适宜的需求量或耐受能力结果差异较大, 蛋白质适宜需求量在36%—45%[15,16], 对糖类的耐受能力可高至40%[17], 脂肪的需求量处于6%—11.31%[13,18,19]。近年来, 养殖户为了片面追求生长速度和产量, 采取过度投喂而造成营养过剩,容易促进鱼体脂肪含量增加。

目前对于黄颡鱼的营养需求研究还不够全面,缺乏完善的黄颡鱼亲本培育饲料。在黄颡鱼养殖过程中大多使用的是膨化饲料, 淀粉是膨化饲料加工成型的关键成分[20], 过量投喂高糖高脂饲料容易造成黄颡鱼肠系膜脂肪堆积和消化系统病变[16,18];而野生黄颡鱼中不存在肠系膜脂肪堆积的现象。目前大多数黄颡鱼苗种场所使用的亲本都是从养殖的商品鱼中挑选的, 存在肠系膜脂肪和内脏脂肪堆积的问题, 容易造成种质的严重退化进而影响苗种的质量。在本研究中, 我们收集了3个不同地区苗种繁育场的雌性亲本并追踪分析母本饲养管理记录, 通过与性成熟的野生雌性黄颡鱼进行繁殖性能比较分析试验, 旨在探索一套适合黄颡鱼全雌配套系的母本培育方式, 提高苗种质量。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验选择3个不同黄颡鱼苗种场(每个苗种场随机挑选5尾雌鱼解剖观察内脏脂肪沉积情况)及湖北省武汉市周边自然湖泊中捕获的性成熟雌性黄颡鱼, 建立4个实验母本群体[平均体重(91.05±16.35) g, 每组50尾]。Group 1为野生黄颡鱼;group 2为肠系膜脂肪较少的黄颡鱼在繁殖前1个月进行强化培育, 培育方式如下: 将鱼糜与甲鱼料(粗蛋白含为46%、粗灰分为17%、 粗脂肪为4.0%和粗纤维为2.0%)进行混合, 第1周鱼糜含量为10%, 第2至第3周鱼糜含量为20%—25%, 第4周鱼糜含量降为10%。group 3和group 4为肠系膜脂肪较多的2个黄颡鱼养殖群体, 一直投喂黄颡鱼商品膨化料(粗蛋白为42.2%、粗灰分为10.1%、粗脂肪为8.1%和粗纤维为2.6%)。试验鱼均放置于规格为2 m×2 m×1.5 m且在表面光滑的养殖池中, 水温控制在23—26℃,昼夜充氧, 暂养48h后分别进行取样和人工催产实验。

1.2 形体指标测量及解剖观察

每个群体随机选取6尾进行取样, 将实验鱼置于200 mg/L MS-222(间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐)的环境中麻醉, 称量体重(Body weight,BW), 取性腺和内脏团, 用滤纸吸取流出的血液, 将完整卵巢和内脏团置于解剖盘上, 拍照记录。然后, 称量性腺重(Gonad weight,GW)、完全剥离后肠系膜脂肪重量(Mesenteric fat weight,MFW), 计算性腺指数(Gonad somatic index,GSI)及肠系膜脂肪指数(Mesenteric fat index,MFI)。

1.3 冰冻切片油红染色

将测量形体指标过程中取得的卵巢和肝脏组织置于4%多聚甲醛中固定48h, 用PBS(pH 7.2)冲洗2次, 30%蔗糖溶液(PBS配制)4℃浸透12h后,OCT包埋剂(Optimal cutting temperature compound)包埋, 用冰冻切片机连续切取4 μm厚度切片。60℃烤片30min, 然后用丙二醇梯度渗透处理, 0.5%油红O染液常温下染色2h后PBS冲洗, 100%丙二醇去背景色后PBS冲洗, 苏木精染液复染10s, 清水冲洗吸干, 明胶封片。在光学显微镜下观察并拍照保存。

1.4 过碘酸-希夫染色(Periodic acid-Schiff, PAS)

将取得的肝脏置于4%多聚甲醛中固定48h; 逐级酒精脱水, 使用石蜡包埋剂包埋, 石蜡切片4 μm;蒸馏水洗涤1—2min, 用1%高碘酸水溶液氧化6—20min, 蒸馏水洗涤数次; 用Schiff试剂染色5—10min, 如果温度低可适当延长染色时间; 倾去Schiff 试剂, 在流水中冲洗, 直至流水颜色由红色变为无色; 用Harri 苏木素染液浅染细胞核2—3min,流水冲洗5—10min; 逐级酒精脱水, 二甲苯透明, 中性树脂封固; 在光学显微镜下观察肝脏组织形态,细胞核为蓝色, 糖原为深紫色, 并拍照保存。

1.5 血清激素和蛋白水平检测

在人工催产前, 每个群体随机选取3尾黄颡鱼,用1 mL注射器从尾部取血, 离心收集血清。分别采用江苏博深生物科技有限公司生产的鱼促黄体生成素(Luteinizing hormone, LH)Elisa试剂盒(BSE17501O2)和鱼卵黄蛋白原(Vitellogenin, VTG)Elisa试剂盒(BS-E17403O2), 测定血清中LH和VTG含量。

1.6 人工繁殖

随机挑选活力良好、无伤病、重量相近且性腺成熟好的雌鱼, 6尾为一组, 每个群体选3组; 选取3条生殖器末端凸起较尖, 有明显红点的雄性黄颡鱼。

催产方式: 催产药物为地欧酮(DOM)、鱼用绒毛膜促性腺激素(HCG)和促黄体激素释放激素(LRH-A2)3种药物配伍。雌鱼采取2针法注射(胸鳍基部注射), 剂量分别为: 第一针, LHRH-A2 12 μg/kg+HCG 150 IU/kg; 第二针, LHRH-A2 18 μg/kg+HCG 1500 IU/kg+DOM 8 mg/kg, 2针间距时间为12h。雄鱼只注射第二针, 且剂量减半[9]。

采用“半干法”进行黄颡鱼人工授精, 达到效应时间前2—3h检查亲鱼状态, 待60%—70%的雌性黄颡鱼个体都能达到顺利排卵的时候, 开始人工挤卵。在卵收集完成后, 称取产卵重量(Oviposition weight,OW), 计算产卵率(Spawning rate,SR); 用已经准备好的3条健康雄性黄颡鱼的混合精液, 进行人工授精。

黄颡鱼受精卵置于玻璃平皿中充气孵化。受精卵发育至原肠胚期后计算卵的总数和受精卵数量以及计算受精率(Fertilization rate,FR)。然后继续充气孵化, 统计孵化出苗数量。待出膜的鱼苗发育至可平游时(96 hpf), 统计鱼苗畸形率(Malformation rate,MR)。当鱼苗能主动开口摄食, 由内源性营养转为混合营养时(144 hpf), 统计鱼苗数量, 计算每尾母鱼的出苗数量(Number of fry produced per female)。

1.7 结果统计及处理

肠系膜脂肪指数(MFI)=肠系膜脂肪重/体重×100

性腺指数(GSI)=性腺重/体重×100

产卵率(SR, %)=产卵重量/卵巢重×100

受精率(FR, %)=受精卵数/总卵数×100

畸形率(MR, %)=畸形苗数量/孵化出苗数量×100

单尾母鱼出苗量=出苗数量/产卵亲本尾数

采用SPSS18.0统计软件进行实验数据的统计学分析, 采用单因素方差分析(One-way ANOVA)进行各组数据的组间差异分析,P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 黄颡鱼母本肠系膜脂肪指数和性腺指数分析

通过解剖测量, 比较野生群体 (group 1)和3个养殖群体(group 2—4)母本肠系膜脂肪沉积及性腺发育情况 (图 1A)。野生黄颡鱼肠系膜脂肪指数(MFI)为(0.56±0.17)%, 在养殖群体中group 2—4分别为(1.97±0.40)%、(5.92±1.85)%和(9.62±1.01)%(图 1B)。在性腺指数 (GSI)上, 野生群体为(14.24±3.21)%, 养殖群体group 2—4分别为(17.95±2.97)%、(10.91±2.56)%和(9.69±2.88)%。野生群体的GSI稍微低于养殖群体group 2, 而group 2的GSI显著高于group 3和4(图 1C)。在人工培育群体中, group 2—4的MFI逐渐升高, 而GSI呈下降趋势(group 3和4由于MFI过高,GSI差异不显著), 故总体上MFI与GSI呈负相关。

图1 四组母本黄颡鱼的内脏解剖图、肠系膜脂肪指数和性腺指数Fig. 1 The anatomy, mesenteric fat index and gonadosomatic index of female yellow catfish in four groups

2.2 卵巢和肝脏组织学分析

肝脏油红染色结果显示, 肠系膜脂肪沉积较少的group 1在肝脏中的油脂滴沉积也较少, 而肠系膜脂肪沉积较多的群体group 3和group 4中, 肝脏中油脂沉积量也随之增加, 肠系膜脂肪与肝脏脂肪含量存在相关性(图 2)。

图2 肝脏油红染色组织切片分析Fig. 2 The oil red staining results of liver in these four groups of yellow catfish

肝脏糖原染色结果如图 3所示, 在group 1和group 2中, 肝脏细胞排列整齐且无糖原沉积, 而在group 3和group 4中, 存在显著糖原沉积, 且细胞出现空泡状, 存在炎症现象。

图3 PAS染色比较分析肝脏组织的糖原含量Fig. 3 PAS staining showing the glycogen content in the liver tissue of four groups of yellow catfish

为了进一步研究脂肪对卵巢发育的影响的规律, 对4个群体中催产前的卵巢进行油红染色和图片梯度可视化分析。发现肠系膜脂肪沉积较少的野生群体group 1在卵子中油脂沉积也较少, 在人工培育群体中, 繁殖性能接近野生的群体group 2, 在卵巢中脂肪的沉积量与野生群体接近。而在肠系膜脂肪沉积较多的群体group 3和group 4中, 卵巢油脂沉积量也随之增加(图 4)。

图4 各群体卵巢油红染色组织切片Fig. 4 The oil red staining results of ovaries in these four groups of yellow catfish

2.3 人工繁殖结果差异分析

人工繁殖结果表明, 野生群体的产卵比[(66.54±12.43)%]与脂肪含量较少的group 2[(63.83±12.03)%]无显著性差异, 但显著高于脂肪含量较高的group 3[(48.56±10.04)%]和group 4[(42.21±8.68)%; 图 5A]。同样地, 受精率随脂肪含量的升高而降低; group 1的受精率[(76.70±3.76)%]与group 2[(77.23±4.76)%]无显著差异(P＞0.05), 但显著高于group 3[(69.02±3.38)%]和group 4[(55.13±5.43)%; 图 5B]。

图5 四个母本群体人工繁殖的产卵比和受精率情况Fig. 5 The spawning rate and fertilization rate of the four female groups

2.4 苗种畸形分类、畸形率及出苗量统计分析

为了更好地评估肠系膜脂肪沉积对苗种的影响, 我们统计了苗种的畸形率和出苗量, 并对其畸形表型进行分类。根据观察结果, 畸形苗种的表型主要有心包水肿、脊椎畸形和断尾, 有些畸形苗种表现出一种表型, 有些则同时表现出两种或者三种表型(图 6)。

图6 96 hpf黄颡鱼畸形苗种的种类Fig. 6 The types of malformation in 96 hpf yellow catfish

统计分析结果表明黄颡鱼苗种畸形率随着母本肠系膜脂肪沉积增多而显著增多(图 7A)。我们选取鱼苗开口摄食, 内源性营养转为混合营养阶段(144 hpf), 进行鱼苗数量统计, 计算每尾亲本出苗量。结果显示, 野生群体出苗量与动物蛋白投喂组无明显差异, 显著高于膨化料投喂群体。结合畸形率和出苗量, 畸形苗在转食阶段出现死亡, 从而造成畸形率与出苗量呈负相关, 同时, 随着肠系膜脂肪沉积增多, 畸形率增高, 出苗量降低(图 7B)。

图7 四个群体人工繁殖的苗种畸形率和单尾鱼出苗量Fig. 7 The malformation rate and number of fry produced per female in these four groups

2.5 母本激素水平分析

黄颡鱼血清中促黄体生成素(LH)和卵黄蛋白原(VTG)水平的测量结果表明: group 1与group 2的LH水平无明显差异(P＞0.05), 而group 3和group 4相较于前两组显著降低(P＜0.05; 图 8A)。在VTG水平上, group 1和2无明显差异(P＞0.05), group 3和group 4显著低于前两组(P＜0.05), 且group 4的VTG含量最低(图 8B)。

图8 母本血清中促黄体生成素和卵黄蛋白浓度Fig. 8 The concentrations of LH and VTG in four groups of females

3 讨论

目前, 一些黄颡鱼苗种场忽视亲本培育, 在亲本培育过程中不合理或过量地投喂成鱼配合饲料,致使培育出的母本普遍存在肠系膜脂肪沉积的现象。本研究系统评价了肠系膜脂肪沉积与黄颡鱼繁育性能的关联, 肠系膜脂肪过度沉积的黄颡鱼母本繁殖性能明显下降, 生产出来的苗种质量欠佳;而使用肠系膜脂肪较少的黄颡鱼, 在繁殖前1个月用动物性蛋白饵料进行强化培育能够显著改善繁殖性能和提高苗种质量。

脂类在鱼类生命代谢过程中具有多种生理功能, 在饲料中添加适量脂类, 能节约蛋白质, 提高饲料蛋白的利用率[21]。鱼类缺乏皮下脂肪层, 脂肪主要蓄积在肠系膜脂肪组织、肝脏及肌肉[13]。蛋白、脂肪和糖类等营养物质摄入过量, 容易在鱼体形成大量的脂肪沉积成为体脂, 引起机体代谢紊乱,造成抗病力降低, 严重危害鱼类的生长和健康[22]。其中肠系膜脂肪沉积重量占鱼体的质量比例与摄入量密切相关。当脂肪沉积超过正常肝脂积累量时, 则表现为出鱼类脂肪肝[23], 甚至产生脂毒性[24]。在本研究中, 肠系膜脂肪沉积量高的群体group 3和4的肝脏脂质和糖原积累显著高于野生群体group 1和肠系膜脂肪沉积量低的群体group 2(图 2和图 3)。

在动物中, 脂肪过度积累会严重影响雌性的繁殖性能; 在母猪妊娠期肥胖研究中发现, 母猪背膘大于24 mm时候, 过度积累的脂肪, 会促进胎盘组织脂质毒性环境发生, 致使氧化应激和炎症反应加剧, 造成弱仔(Low Birth Weight, LBW)比例增加[24]。肝脏能够合成卵黄源蛋白等高密度脂蛋白及为卵发育提供能量的中性脂油滴, 其转运至卵巢并调控卵巢的发育[25,26]。在Mansour等[27]研究中发现脂滴均匀分布的卵为好卵, 受精率较高, 而脂滴均匀成块、大面积分布的卵为坏卵, 受精卵低或无法受精。在本研究中, group 1和2中脂质均匀分布在卵母细胞中, 而group 3和4中脂质成块堆积在卵母细胞中(图 4), 表明group 1和2的卵巢和卵子质量比group 3和4好; 因此, group 1和2的产卵比、受精率和出苗量高, 且畸形率低(图 5—7)。脂肪过度积累甚至还会隔代遗传影响动物子代胚胎质量和代谢功能, 在连续16周高脂投喂的小鼠模型中, 其卵子质量、排卵率和子代胚胎发育均比正常投喂组差[28,29];高糖高脂饮食导致肥胖会损伤小鼠的卵子质量, 这种影响甚至会持续三代[30]。

在人类中, 越来越多的研究表明, 肥胖会对女性生殖系统产生不良影响, 引起生育能力下降及性激素的缺乏[31]。促黄体生成素(LH)是由腺垂体细胞分泌的一种促性腺激素, 可促进胆固醇在性腺细胞内转化成性激素。在肥胖女性中, LH激素水平显著低于正常体重女性[32,33]。在鱼类卵巢中, LH与FSH共同作用, 促进卵泡分泌甾体激素, 触发排卵[34]。卵黄蛋白原(Vitellogenin, VTG)是进行卵黄合成的重要物质, 是鱼类生殖过程中重要的生殖蛋白[35]。VTG在肝脏中合成, 后随血液循环进入卵母细胞,在卵母细胞发育过程中水解为卵黄蛋白[36], 可为将来胚胎生长发育提供必需的营养。在爪蟾中,VTG能转运Zn2+, Zn2+对胚胎发育非常重要, 缺乏会导致胚胎器官畸形[37]。本研究结果发现, 脂肪高的群体group 3和group 4血清LH和 VTG水平显著低于脂肪低的野生群体和group 2(图 8)。此外, 脂肪过度沉积的母本在注射催产药物后, 会发生排卵不完全甚至不排卵, 从而导致母鱼大量死亡, 这在很大程度上影响了黄颡鱼苗种生产和产业的进一步发展[38, 39]。

综上所述, 黄颡鱼母本脂肪过度沉积会影响卵子和苗种质量, 而肠系膜脂肪指数(MFI)可以作为一个很好的脂肪含量指示参数。在黄颡鱼等杂食性和肉食性鱼类的亲本培育过程中, 不能按照传统的商品鱼养殖方式, 要制定一套合理的亲本培育操作规范; 只有深入研究和了解亲本的营养需求, 合理投喂减少肠系膜脂肪沉积, 改善繁殖性能, 才能生产出高质量的苗种。