肝纤维化中上皮间质转化的调控及靶向治疗的研究进展

王永娟，谢肖立，姜慧卿

河北医科大学第二医院 消化内科，河北省消化病重点实验室，河北省消化病研究所，石家庄 050000

肝纤维化是各种慢性肝脏疾病共同的病理过程，严重者会进展为肝硬化和/或肝癌。肝纤维化的病理基础是细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的过度沉积，而肌成纤维细胞是ECM的主要来源。近年来，上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)被认为是肝纤维化中产生肌成纤维细胞的机制之一。现有研究表明，肝细胞(hepatocytes，HC)、胆管上皮细胞、肝祖细胞(hepatic progenitor cells，HPC)及肝星状细胞(HSC)均可通过EMT而促进肝纤维化[1]。目前，已有较多学者报道了通过调控EMT相关的信号通路能够治疗肝纤维化，本文将对现有的文献进行综述，以期为治疗肝纤维化提供新思路。

1 EMT的定义及特点

1.1 EMT的定义 EMT是指贴壁上皮细胞获得间质细胞的特点，迁移及侵袭能力增强的生物学过程[2]。Greenberg等[3]于1982年首次提出了EMT的概念，他们发现在凝胶中培养的晶状体上皮细胞失去了极性，转变为间质样的细胞。已经证实EMT在胚胎发育、慢性炎症、组织重建、癌症转移和多种纤维化疾病中发挥重要作用。

1.2 EMT的特点 EMT最基本的特征是细胞表型的转化。在EMT过程中，上皮细胞与基质之间的紧密连接受损,闭锁小带蛋白-1(zonula occludens-1, ZO-1)及维持细胞极性、形态的黏附连接蛋白E-钙黏蛋白(E-cadherin)缺失，开始表达间质细胞标志蛋白,包括N-钙黏蛋白(N-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、成纤维细胞特异性蛋白-1(fibroblast-specific protein 1，FSP-1，又称为S100A4)，蜗牛同源物1(Snal1)，蜗牛同源物2(Snal2)和twist等；细胞骨架蛋白重排，由上皮细胞的角蛋白转变为间质细胞的波形蛋白；发生EMT后细胞的迁移和侵袭能力明显增强[2,4]。

EMT的另一个特征是可逆的，逆转过程是间质上皮转化，即间质细胞转化获得上皮细胞的特性[5]。术语“部分EMT”用于区分细胞尚未完成“全面EMT”的上皮细胞，即细胞已经获得间质指标，但仍然表达上皮标志[2]。

2 EMT的分型及与肝纤维化的关系

鉴于EMT发生在不同的生物学过程中，Kalluri等[2]在冷泉港EMT会议上，将EMT分为三种：Ⅰ型与移植、胚胎形成及器官发育相关；Ⅱ型与伤口组织愈合，重塑或者器官纤维化相关；Ⅲ型与癌变相关。Ⅱ型EMT通常由炎症信号介导，并且在修复完成且炎症减轻时停止。但是，在持续的损伤和炎症下，Ⅱ型EMT可以继续生成肌成纤维细胞，这些肌成纤维细胞不断积累，最终引起器官纤维化。Ⅱ型EMT在肝纤维化疾病中发挥重要作用，是引起肝纤维化中产生分泌胶原的成肌纤维细胞的机制之一[2,6]。肝脏内能够发生EMT的细胞主要包括HC、胆管上皮细胞、HPC和HSC。

3 肝纤维化中EMT相关的信号通路

肝纤维化中的EMT涉及许多信号传导途径，包括TGFβ1/Smad及TGFβ1/non-Smad，Wnt/β-catenin，Hedgehog(Hh)和Notch信号通路等。

TGFβ1是肝纤维化中引发EMT最重要的细胞因子。TGFβ1与其受体结合，触发形成Ⅰ型和Ⅱ型丝氨酸/苏氨酸激酶受体的异四聚体复合物,活化的受体复合物通过其羧基末端的受体激活Smad2/3复合体，从而介导经典的TGFβ1信号传导。激活的Smad2/3与Smad4结合并移位至细胞核,在细胞核内激活调控的转录因子如Snail、ZEB1、Slug、Twist等[7]，进而调控肝上皮细胞、HSC及HPC EMT。除了经典的Smad途径，TGFβ1还能够通过非Smad效应来介导生物学反应，包括非受体酪氨酸激酶蛋白(如Src和FAK)，细胞存活的介导子(如NF-kB、PI3K/Akt途径)，MAPK(ERK1/2、p38 MAPK和JNK等)和Rho GTPases(如Ras、RhoA、Cdc42和Rac1)[8]。

Hedgehog(Hh)蛋白是一种由上皮细胞分泌的信号蛋白,具有调节组织损伤后重建和再生功能。可溶性Hh配体(Sonic Hh、Indian Hh和Desert Hh)与Hh反应性细胞上的Patched(Ptc)受体相互作用。这种配体-受体相互作用可防止Ptc抑制其共受体Smo。激活的Smo反过来会引发一系列细胞内事件，最终导致胶质母细胞瘤(Gli)家族转录因子的激活和核定位，从而促进了Snail和Twist的表达，诱导EMT的发生[9]。

Notch信号通路由Notch受体、Notch配体(DSL蛋白)、CSL (CBF-1，Suppressor of hairless，Lag的合称)DNA结合蛋白、其他的效应物和Notch的调节分子等组成。Notch信号的产生是通过相邻细胞的Notch配体与受体相互作用，Notch蛋白经过3次剪切，由胞内段(NICD)释放入胞质，并进入细胞核与转录因子CSL结合,形成NICD/CSL转录激活复合体，从而激活HES、HEY、HERP等碱性-螺旋-环-螺旋转录抑制因子家族的靶基因，诱导EMT的发生[10]。

Wnt/β-catenin信号传导途径是由配体蛋白质Wnt和膜蛋白受体结合激发的一组多下游通道的信号转导途径。典型Wnt/β-catenin信号通路能够激活核内靶基因的表达，诱导EMT的发生[11]。

4 通过EMT影响肝纤维化的核酸分子

4.1 长非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA) lncRNA是一种长度大于200个核苷酸，没有蛋白编码能力链非编码RNA。与EMT相关的lncRNA主要包括lnc-Hser、lnc-Meg8、lnc-Meg3、lnc-H19、lnc-LFAR1等。Zhang等[12]研究表明，lnc-Hser通过C5AR1-Hippo-YAP途径抑制HC凋亡，并通过Notch信号通路抑制HC发生EMT，从而抑制肝纤维化的发生。Chen等[13]研究表明，lnc-Meg8能够通过Notch途径抑制HSC活化和HC EMT，从而抑制肝纤维化的发生。He等[14]研究表明，lnc-MEG3通过SMO蛋白和miRNA-212抑制Hh信号通路介导的HSC EMT样过程。Zhu等[15]研究表明，lnc-H19能够抑制miRNA-148a的表达，促进TGFβ介导的HSC及HC的EMT。Zhang等[16]研究表明，lnc-LFAR1能够促进Smad2/3与TGFβ受体1的结合及其在细胞质中的磷酸化，从而抑制HC EMT及HSC EMT样过程。

4.2 微小RNA(microRNA, miRNA) miRNA是一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小为20～25个核苷酸。与EMT相关的miRNA主要包含miRNA-146a、miRNA-21、miRNA-200a、miRNA-155等。Zou等[17]研究发现，在CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型中，静脉注射miRNA-146a高表达的腺病毒(Ad-miRNA-146a)后，能够抑制HC EMT和Smad4的表达，通过抑制TGFβ介导的EMT，抑制肝纤维化的发生。Wu等[18]研究表明，在180例不同时期肝硬化患者血清中miRNA-21水平显著升高，且与肝硬化的严重程度和活动性有关。并建立CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型，在予以Ad-TuD-21治疗后，大鼠肝纤维化程度明显减轻。研究表明，在体敲低miRNA-21通过抑制ERK1信号通路，抑制HC EMT的发生。Yu等[19]研究表明，miRNA-200a在CCl4诱导的肝纤维化及HSC中的表达水平降低。miRNA-200a能够抑制Hh信号通路的下游信号蛋白Gli2，抑制了HSC中的EMT样过程。Dai等[20]研究表明，miRNA-155在肝硬化患者的肝脏组织、激活的HSC中的表达水平均显著降低。过表达miRNA-155能够降低间质标志物和ERK1磷酸化水平。

4.3 寡核苷酸 转录因子诱饵寡核苷酸(transcription factor decoy oligodeoxynucleotides，TFD-ODN)是短双链(ds)DNA，在靶基因的调控位点(即启动子或增强子)携带已知的转录因子或DNA识别基序的保守结合序列。采用诱饵策略通过使用合成的TFD-ODN能够阻断转录因子的活性。与EMT相关的TFD-ODN主要包括TGFβ1/Smad ODN、NF-κB ODN。Gwon等[21-22]用TGFβ1和TGFβ1/Smad ODN处理的AML12细胞形态保留了上皮特征，TGFβ1/Smad ODN中E-cadherin的表达水平升高，而Vimentin的表达则降低。在CCl4诱导的肝纤维化小鼠模型中，TGFβ1/Smad ODN能够通过抑制TGFβ1表达和Smad转录因子，抑制肝纤维化的进展。Kim等[23]研究表明，在体外NF-κB诱饵ODN有效抑制了TGFβ1诱导的AML12 EMT，在体内抑制了CCl4诱导的肝纤维化。

5 以EMT为靶点的抗肝纤维化药物

某些特定的药物通过靶向调控EMT，发挥抗肝纤维化的作用。以下总结了通过抑制EMT减轻肝纤维化的药物，供临床工作者参考。

5.1 抗肿瘤药物(索拉非尼和氟伐他汀) Hao等[24]研究表明，索拉非尼主要通过JNK和Akt信号通路诱导HSC自噬和凋亡，从而抑制肝纤维化的进展。Cheng等[25]通过二乙基亚硝胺诱导建立了大鼠肝纤维化模型，结果表明，索拉非尼联合氟伐他汀能够在体内明显降低胶原蛋白的含量及α-SMA、层黏连蛋白水平，并显著抑制了HC中间质标志物N-cadherin、Vimentin的表达,促进了上皮标志物ZO-1的表达。在体外，索拉非尼联合氟伐他汀能够上调HSC中Claudin-1的表达，上调间质指标Vimentin的表达。机制上，索拉非尼加氟伐他汀通过抑制HC和HSC中TβRII的磷酸化阻断TGFβ1/Smad3的信号通路,从而抑制HC和HSC EMT的发生。

5.2 分子靶向药物——Vismodegib(GDC-0449，简称GDC) Pratap等[26]研究比较了两种已知的Hh拮抗剂GDC和环孢素的抗纤维化能力，建立了胆管结扎大鼠肝纤维化模型，研究表明，环孢素和GDC能够减轻大鼠早期肝纤维化，改善肝功能，阻止HSC活化，上调上皮标志E-cadherin的表达，而使间质标志如α-SMA、FSP-1和TGFβ1表达下调。因此，GDC能够通过抑制Hh信号通路，抑制HSC EMT样过程，从而延缓肝纤维化的发生。

5.3 中药

5.3.1 卡诺醇 卡若索尔是一种从迷迭香中提取的化合物，具有多种药理活性。Zhao等[27]建立了CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型，并用TGFβ1刺激AML12和LX-2细胞，研究结果发现，卡若索尔能够在体外抑制AML12和LX-2细胞EMT，上调E-cadherin的表达，下调Vimentin的表达。在体内，卡若索尔能够抑制肝脏中Vimentin的表达，上调E-cadherin的表达，从而抑制肝纤维化的发生。机制上，卡若索尔抑制了增强的Zeste同源2，并使SIRT1的活性增强，从而抑制HC的EMT及HSC的EMT样过程，抑制肝纤维化的发生。

5.3.2 蜂毒肽(melittin，MEL) MEL是蜂毒的主要成分，对类风湿关节炎、癌细胞增殖、纤维化和免疫疾病有效。Park等[28]建立了CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型，并用TGFβ1刺激AML12和HSC，发现MEL在体外能够抑制AML12和HSC EMT，上调E-cadherin和ZO-1的表达，而下调纤连蛋白和Vimentin的表达，而在CCl4诱导的肝纤维化小鼠体内，能够上调E-cadherin，下调Vimentin的表达。机制上，研究表明，蜂毒肽能够通过抑制TGFβ/Smad和TGFβ/non-Smad-MAPK信号通路，抑制HSC及HC EMT，从而抑制肝纤维化的发生。

5.3.3 丁烯酞(BP) BP是中国药材当归、川穹中的成分。Chuang等[29]建立了CCl4诱导的肝纤维化大鼠模型，研究BP对HSC EMT及肝纤维化的作用，研究发现，在肝脏组织中，BP能够使BMP-7的表达上调，而TGFβ表达下调。通过提取大鼠原代HSC，研究BP在体外对HSC EMT的作用，研究发现，BP能够抑制TGFβ和α-SMA的表达，而上调BMP-7的表达。机制上，BP通过调节BMP-7来降低EMT，以改善肝纤维化。

5.3.4 麦角甾醇 麦角固醇是一种活性化合物，通常存在于冬虫夏草、香樟和蛹虫草中。Tai等[30]建立了晚期糖基终产物诱导的小鼠肝纤维化模型，研究角固醇对HSC-T6细胞中RAGE信号传导的影响。麦角固醇抑制了AGE诱导的HSC-T6的活化，并减弱了α-SMA，MMP-9和EMT间质标志物如N-cadherin和Vimentin的表达。机制上，麦角固醇通过上调过氧化物酶体增殖物激活的受体γ抑制HSC EMT，从而抑制肝纤维化的发生。

5.3.5 扶正化瘀方药 扶正化瘀配方包括汤剂丹参、桃仁、冬虫夏草、松花粉和绞股蓝。Song等[31]通过TGFβ1刺激大鼠原代HSC，研究扶正化瘀方药对HSC EMT及肝纤维化的作用，研究发现，扶正化瘀方药能够上调上皮标志E-cadherin的表达，而下调间质标记物α-SMA和结蛋白的表达。另外，扶正化瘀能够上调BMP-7表达，并能够抑制TGFβ的表达。机制上，扶正化瘀方药通过抑制p38蛋白激酶从而抑制TGFβ1信号通路，使HSC EMT逆转。

5.3.6 丹酚酸B(Sal B) Sal B是从丹参中提取的主要水溶性组分。Yu等[32]建立了CCl4诱导的肝纤维化小鼠模型，研究Sal B丹酚酸B对肝纤维化的作用，研究发现，Sal B改善了CCl4诱导的肝纤维化，Sal B能够上调HSC中结蛋白和Vimentin的表达，而抑制E-cadherin的表达。机制上，Sal B能够上调PTCH1的表达，可逆转由CCl4引起的PTCH1的DNA甲基化，从而通过抑制Hh信号通路，抑制HSC EMT，延缓肝纤维化的发生。

5.3.7 栀子苷 栀子苷是栀子中一种重要的环烯醚萜类化合物，具有广泛的药理活性。Park等[28]通过TGFβ1刺激AML12，研究栀子苷对AML12 EMT的作用。研究发现，京尼平苷显著抑制TGFβ1诱导的COL1α1的mRNA和蛋白表达，而且能够上调上皮标志物E-cadherin表达，抑制间质标志物Vimentin的表达。机制上，京尼平苷阻断了AML12细胞中Smad2/3、ERK和Akt的磷酸化。综上所述，京尼平苷可能通过抑制TGFβ/Smad和ERK MAPK信号通路，抑制TGFβ1诱导的HC EMT，从而抑制肝纤维化的发生。

5.3.8 隐丹参酮(cryptotanshinone，CRY) Ren等[33]建立了CCl4诱导的肝纤维化动物模型,评估CRY对HC EMT及肝纤维化的作用。研究表明，CRY能够抑制HC发生EMT，并减轻肝纤维化的程度。机制上，miRNA-539-3p是CRY调节靶点，CRY促进了miRNA-539-3p的表达，后者抑制了SMO，从而抑制HC的EMT过程。因此，CRY通过miRN-539-3p靶向抑制Hh途径，从而抑制HC EMT，延缓肝纤维化的发生。

5.3.9 异甘草酸镁 异甘草酸镁在临床上被用作肝保护剂。Yang等[34]建立了高果糖诱发的大鼠肝纤维化模型，高果糖摄入降低了miRNA-375-3p表达，并激活JAK2/STAT3和TGFβ1/Smad信号转导。将BRL-3A细胞和/或原代大鼠HC予以高果糖刺激，然后用miRNA-375-3p模拟物或抑制剂转染，或用JAK2抑制剂处理，研究发现，异甘草酸镁增加了miRNA-375-3p的表达，从而抑制了JAK2/STAT3途径和TGFβ1/Smad信号传导，从而减轻了肝纤维化。

6 结语

HC、胆管上皮细胞、HPC EMT及HSC EMT样过程是肝纤维化发展过程中的重要机制。TGFβ1/Smad、TGFβ1/non-Smad、Wnt/β-catenin、Hedgehog(Hh)和Notch通路等是参与肝纤维化EMT的重要信号通路，另外，某些核酸分子如lncRNA、miRNA、TFD-ODN等在肝纤维化EMT中也起到重要作用，以这些通路及分子为靶点，能够抑制肝纤维化的发生和发展。临床上，通过调控EMT抑制肝纤维化的药物主要包括抗肿瘤药物、分子靶向药物及中药，其中，中药及相关成分的研究最广泛，这些药物为肝纤维化的治疗提供了新的思路。

作者贡献声明：王永娟负责课题设计，资料分析，撰写论文；谢肖立参与收集数据，修改论文；姜慧卿负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。