褪黑素对猪精液体外保存质量影响的研究

张丹，殷茵，刘建文，崔茂盛

摘要：随着养猪行业良种化水平逐渐提高和人工授精技术在集约化养猪场中的推广与应用，精液高效保存技术越来越受到重视。本文通过试验的方式在现有猪精液稀释液中加入0.5、0.8、1.2和2g/L等不同浓度的褪黑素，以猪精子体外存活时间、质膜完整性和活率等为评价指标，在猪精液体外保存技术体系下，筛选最佳的褪黑素添加量，同时根据试验实际效果，用常温保存3d的精液进行了输精试验，验证该稀释粉对精子的保护效果。

关键词：猪;精液保存;添加褪黑素

目前天津市乃至全国生猪养殖行业中，种公猪精液利用率不足，大多猪场人工输精所用精液多数来自当天采集，或来自17℃存储1～2d的精液;市场上中效、中长效和长效等猪鲜精稀释粉大部分被养猪发达国家所垄断，价格较高，給养猪生产企业带来较大经济压力，增加了企业生产成本。

随着养猪行业良种化水平逐渐提高和人工授精技术在集约化养猪场中的推广与应用，精液高效保存技术也变得重要，并日益显示出降低公猪饲养量和饲养成本、加快猪群品种改良、减少疾病传播等多方面优势;因可通过引进优秀公猪精液代替引进活体公猪，减少了育种成本，故提高优秀种公猪精液高效保存与利用技术意义变得尤为重大。

液态保存精液具有繁殖成绩好、所需费用低、操作程序简单、能创造更大的经济效益等优点。因此，近年来常温保存精液技术已广泛应用于猪的人工授精中，国内外研究者围绕猪精液常温保存稀释液开展了大量的研究工作。目前国内外常用的猪精液常温稀释液中的主要成分有：稀释剂、营养剂、保护剂和抗菌剂。除此之外，稀释液中含有针对性的抗菌成分可预防精液中细菌的生长和生殖性疾病的传播。稀释剂中碳酸氢钠和柠檬酸钠作为缓冲液。氯化钾以低浓度用于维持Na+-K+泵，防止细胞外K+耗竭而使细胞失去活力。EDTA能捕获二价的金属离子，尤其是Ca2+，可能抑制跨膜运动而阻止获能的启动和顶体反应。稀释剂中使用EDTA对推广猪精子液态保存是很重要的一步。此外，在精液的两个降温平衡阶段，精子的呼吸代谢会产生大量的活性氧族，其中的氧自由基（O2-、H2O2和-OH）能使精子细胞膜中不饱和脂肪酸发生过氧化反应，导致精子质膜损伤[1]。

笔者基于前期在猪精液高效保存技术的研究成果，在现有猪精液稀释液中加入0.5、0.8、1.2和2g/L等不同浓度的褪黑素，以猪有效精子数、畸形率和活率等为评价指标，在猪精液体外保存技术体系下，筛选最佳的褪黑素添加量，同时根据试验结果，用常温保存3d的精液进行了输精试验，验证该稀释粉对精子的保护效果。

1 试验设计

将采集的精液平均分为两部分，分别为对照组和试验组。将对照组的精液采集后用37℃预热的BTS稀释并调节精子密度，使稀释后的精子密度为0.4×108个/mL左右;而试验组的精液采集后，用以BTS为基础稀释液，分别适当添加不同浓度0.5、0.8、1.2和2g/L的褪黑素，探讨抗氧化剂褪黑素对猪精液保存的效果。精液稀释比例和对照组相同。

2 精液稀释与分装

首先将精液均分为2部分，然后将其中一部分用37℃预热的BTS液根据原精密度、活力、活率等指标进行稀释（对照组），使稀释后的精子密度为0.4×108个/mL左右;另一部分用研发的稀释液进行稀释，稀释比例与对照组相同（试验组）。将稀释后的精液在室温下（26～28℃）放置30min后，分装于集精瓶中，每瓶分装80mL。

3 精液保存

精液分装后，对照组和试验组各随机留出2瓶，放入17℃恒温箱中保存，每12h翻动一次集精瓶，以防止精子假死。

4 精液质量检测

4.1 有效精子数和精活力

笔者使用了“自动精液分析仪”，将待使用精液恢复到室温后进行检测，以确定其指标均在合格范围内。

4.2 精子的畸形率

笔者使用了快速染色法，为样品染色，检测精液的畸形率。

5 试验结果

本试验重复30余次，结果表明在BTS稀释液中添加不同剂量的褪黑素均对精液保存有较好影响，其中0.8g/L的褪黑素组对猪鲜精保存效果最好，平均有效保存天数大于6d。而稀释液中褪黑素含量达2g/L时，精液保存质量又有所降低，平均有效保存天数为3d左右，但仍明显好于对照组（无添加组：2.3d）。

6 结论与展望

不同品种、不同个体公猪精液质量之间差异较大。公猪个体选择非常重要，包括常规选择和精液适用性选择两层次。常规选择首先包括：年龄在2～4岁，体况：中等偏瘦、四肢健壮有力，性欲较好，无烈性传染病史;然后，原精质量较好：染色乳白色，无黄色或红色掺杂其中、密度较高，3～5亿/mL，气味：略带腥味，无恶臭等异常气味;射精量在200～500mL，精子活率在0.85以上，精子畸形率低于5%等，通过前期试验，笔者最终选择了繁殖性能良好、性欲旺盛、没有遗传疾病、年龄在2～4岁的5头种用公猪的精液为研究对象。

笔者根据试验结果继续分成试验组和对照组进行进一步的验证。其中试验组是用稀释液高倍稀释后保存3d的精液，对适配母猪人工输精。而对照组是用当天采集的精液进行人工输，稀释粉为猪场自购某国外品牌。

结果表明用保存3d的精液进行深部输精，输精后母猪妊娠率、窝产子数等繁殖指标仍高于对照组，而窝产子数、窝均初生重及28日龄断奶体重等生长指标与对照组无差异，足以证明合理量的加入褪黑素，对精液的保存以及质量均存在有效的提高。

在鲜精保存中长效稀释粉研发方面，精子活率维持在60%以上的天数达5～7d，效果稳定。而且精液保存到3～4d时，精子活力比稀释后的第1d有明显提高。深部输精资料结果统计表明，猪鲜精高倍稀释后用保存3d的精液，深部输精效果优于猪场正常输精组。本项目的研究成果将够更好服务于我国生猪企业的快速、健康发展。

依据笔者的研究表明：精子活率维持在60%以上的天数达5～7d，效果稳定，若公猪精子质量本身较高，可以有效保存10d甚至更长时间。猪原精经高倍稀释后，3～4d精子活动能力却明显高于稀释后当天的精液，用保存3d的精液深部输精后，妊娠率、产仔数等繁殖指标高于正常输精组[2，3]。

我国是养猪大国，猪精液鲜精保存技术体系及应用可为猪场开展杂交改良、品种选育及代替种公猪引进、促进优秀种公猪的种质资源跨地域和时空传播提供技术保障;中长效稀释粉的研发成功，可为广大的养猪企业和种公猪站降低饲养规模，充分发挥种公猪的种用价值，优化猪场生产结构，减少生产成本，提高企业经济效益等多方面都具有重要作用。综上分析，本项目成果市场推广应用前景广阔，对畜牧业经济发展和科技进步具有重要意义。

参考文献：

[1] 孙琳琳.褪黑素对猪精液常温保存效果的研究[D].西北农林科技大学，2020.

[2] 刘兆军，谢景兴，魏宁，等.稀释剂添加物在猪精液常温保存中的研究进展[J].畜牧兽医杂志，2016，35（6）：67-69.

[3] 梅花，韩朝洛蒙，阿露斯，等.浅谈褪黑素在动物生产中的作用[J].中国畜禽种业，2018，14（11）：73.