基于网络药理学和分子对接技术探讨八珍汤治疗压疮的作用机制

陆海艳 牧晶 孙连祺 黄禾青 于道远 杜冠潮 代红雨

〔摘要〕 目的 采用網络药理学方法和分子对接技术探讨八珍汤治疗压疮的作用机制。方法 通过中药系统药理学技术平台（TCMSP）、UniProt、DrugBank数据库获取八珍汤中药物的活性成分及其潜在的作用靶点。借助OMIM数据库和GeneCards数据库检索压疮的相关靶点，获取药物与疾病的交集靶点并将其导入STRING数据库进行蛋白互作分析，通过Cytoscape 3.7.2软件将互作结果可视化。运用DAVID平台对交集靶点进行GO和KEGG富集分析，预测八珍汤治疗压疮的可能机制与通路。通过AutoDock Vina软件对核心活性成分和靶点进行分子对接验证。结果 检索出八珍汤中有效活性成分150个，潜在靶点230个，涉及压疮的靶点有131个。核心成分有槲皮素、柚皮苷、山柰酚等，关键靶点涉及AKT1、IL-6、MAPK1、MAPK8、STAT3、VEGFA、EGF、IL-1β等。GO功能富集分析得到345个条目，其中生物过程256个、细胞组成38个、分子功能51个。KEGG通路富集筛选得到116条信号通路，PI3K-Akt、HIF-1、VEGF、MAPK、TNF等信号通路是八珍汤治疗压疮重要的潜在通路。同时，分子对接结果表明槲皮素、山柰酚、查尔酮A、柚皮苷、芒柄花素与AKT1、IL-6、MAPK1、MAPK8、STAT3、VEGFA、EGF、IL-1β有很好的结合能力。结论 八珍汤治疗压疮具有多成分、多靶点、多通路的治疗特点，可能通过调节炎症反应、促进血管生成、抑制细胞凋亡等途径促进压疮愈合。

〔关键词〕 八珍汤;压疮;网络药理学;分子对接;作用机制;信号通路

〔中图分类号〕R285.5       〔文献标志码〕A        〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.12.017

Mechanism of Bazhen Decotion for Pressure Ulcer Based on Network

Pharmacology and Molecular Docking Technology

LU Haiyan1， MU Jing2， SUN Lianqi3， HUANG Heqing1， YU Daoyuan1， DU Guanchao4， DAI Hongyu3*

（1. Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China; 2. Yunnan University of Chinese Medicine， Kunming，

Yunnan 650500， China; 3. Dongfang Hospital of Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100078， China;

4. Graduate School of Chinese Academy of Traditional Chinese Medicine， Beijing 100700， China）

〔Abstract〕 Objective To investigate the mechanism of Bazhen Decotion in the treatment of pressure ulcer by using network pharmacology and molecular docking technology. Methods Through traditional Chinese medicine system pharmacology （TCMSP）， UniProt database and DrugBank database， the active ingredients and possible targets of Bazhen Decotion were obtained. Relevant targets for pressure ulcer were retrieved by using OMIM and GeneCards databases. The common targets of drugs and disease were obtained and imported into the STRING database to make protein interaction analysis. The interaction result was visualized by Cytoscape 3.7.2 software. GO and KEGG enrichment analysis were performed on the common targets in the DAVID database to predict the possible mechanism and pathway of Bazhen Decotion in treating pressure ulcer. The molecular docking analysis of core active components and core targets was carried out by using AutoDock Vina software. Results A total of 150 effective active components combined with 230 potential targets were searched from Bazhen Decotion， of which 131 targets involved in pressure ulcer. The core components were quercetin， naringenin， kaempferol， etc. The key targets were AKT1， IL-6， MAPK1， MAPK8， STAT3， VEGFA， EGF， IL-1β， etc. There were 345 GO entries， including 256 items of biological process， 38 items of cell composition， and 51 items of molecular function， and 116 KEGG pathways were enriched and screened. PI3K/Akt， HIF-1， VEGF， MAPK， TNF and other signaling pathways were important potential pathways of Bazhen Decotion in the treatment of pressure ulcer. At the same time， the molecular docking results showed that quercetin， kaempferol， licochalcone A， naringenin， formononetin had good binding ability with AKT1， IL-6， MAPK1， MAPK8， STAT3， VEGFA， EGF， and IL-1β. Conclusion The mechanism of Bazhen Decotion in the treatment of pressure ulcer involves multiple components， multiple targets and multiple pathways. It can promote the healing of pressure ulcer by regulating inflammatory response， promoting angiogenesis and inhibiting apoptosis.

〔Keywords〕 Bazhen Decotion; pressure ulcer; network pharmacology; molecular docking; mechanism; signal pathway

压疮是由于身体局部组织长期受压，发生持续性缺血和缺氧而导致的皮肤和（或）皮下组织的局部损伤[1]。根据损伤程度的不同压疮有不同的临床表现，严重者可引起全身感染，危及生命。随着人口老龄化社会的来临，压疮已成为一个越来越严重的慢性病并发症，世界伤口愈合联合会证实压疮的高发及难愈合会导致患者住院周期延长、生活质量下降，同时造成医疗资源的占用，带来严重的社会负担[2-3]。中医药在压疮的治疗上有着悠久的历史和独特的优势，压疮属于中医学“席疮”“褥疮”“溃疡”等范畴，虽发生于局部皮肉筋骨，属外证，然其“必先受于内，然后发于外”，故在治疗时应注重内治法的应用，从整体上调节五脏六腑气血。中医内治法是疮疡治疗的重要方法[4]，其中补法是疮疡内治的三大法则之一。中医学认为压疮是由于久病卧床，气虚血瘀，血脉不通，肌肤失养所致[5]。压疮患者的全身状态较差，多因其自身基础疾病的消耗所致，加之久卧伤气，导致气血益亏，正气不足，创面愈合困难。气血两虚证是压疮的常见证型之一，针对这一病机，补益气血法在压疮的治疗中发挥着重要的作用[6-7]。

八珍汤源自古方《正体类要》，为气血双补代表方剂，临床常用于治疗气血两虚诸证，包括压疮的临床治疗[8-9]。《外科正宗》及《疡科心得集》均记载其可治疗疡科气血俱伤，久不收敛等溃疡诸证。《疮疡图谱》治疗压疮以补益气血、托毒生肌为法，方药选用八珍汤内服[10]。有实验研究[11]证明，八珍汤能上调大鼠创面血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）的表达水平，改善局部组织的缺血状态，诱导新生血管形成，从而促进创面修复愈合。八珍汤还可促进人皮肤成纤维细胞增殖及表皮生长因子（epidermal growth factor， EGF）、转化生长因子β1（transforming growth factor β1， TGF-β1）等分泌，从而加速血管再生，促进肉芽组织生长及创面上皮化，有助于创面愈合[12]。李静等[13]用八珍汤内服联合外敷治疗压疮20例，总有效率达95%。李倩、靳楠楠等[14-15]研究发现，加用八珍汤内服用于压疮的治疗较单纯对照组临床疗效更显著。但目前八珍汤治疗压疮的作用机制尚不明确。网络药理学是系统生物学重要的组成部分，能建立“成分-药物-靶点-疾病”多重网络关系，从整体上探索中药复方治疗疾病的作用机制，与中醫药治疗疾病的整体观相吻合[16]。因此，本研究旨在运用网络药理学的方法筛选出八珍汤与压疮相关的活性分子和靶点，构建成分-靶点网络，并对靶点进行富集分析，结合分子对接验证来预测中药复方八珍汤治疗压疮的潜在作用机制，以期为基础研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1  八珍汤成分、靶点筛选

通过中医药系统药理学平台（TCMSP，http：//tcmspw.com/index.php）查找八珍汤中八味中药的活性化学成分，设置口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且类药性（drug-likeness， DL）≥0.18进行筛选，获得八珍汤中八味中药的活性成分。通过TCMSP数据库、DrugBank数据库（https：//go.drugbank.com/）得到潜在的蛋白质靶点，将筛选出的蛋白质靶点在UniProt数据库（https：//www.uniprot.org）转换为标准化的基因名称。

1.2  压疮相关靶点筛选

分别在OMIM数据库（http：//www.omim.org）和GeneCards数据库（https：//www.genecards.org）中以“pressure ulcer”为关键词进行检索，获得与压疮相关的靶点基因。若GeneCards数据库中检索到的靶点过多，可根据Score值来筛选靶点的数量。Score值越大则说明靶点与疾病的关联性越强，通常设定Score值大于中位数的靶点为疾病的潜在靶点。将两个疾病数据库获得的靶点合并去重后得到压疮的相关靶点。

1.3  有效靶点的获取及相关作用网络的构建

利用韦恩图将八珍汤靶点与压疮靶点取交集，获得二者的交集靶点，即为八珍汤治疗压疮的有效靶点。将有效靶点导入STRING数据库（https：//string-db.org），构建蛋白相互作用（protein-protein interaction， PPI）网络，选取可信度≥0.7的数据，将结果以tsv格式导入Cytoscape 3.7.2软件进行可视化分析。

1.4  “活性成分-有效靶点”网络构建分析

将药物活性成分与有效靶点基因导入Cytoscape 3.7.2软件进行网络构建及可视化分析，通过分析度值等网络拓扑参数来评价药物活性成分及其作用靶点的重要性。

1.5  靶点功能与通路的富集分析

将有效靶点导入DAVID数据库中进行GO注释分析与KEGG通路分析（P<0.05），GO富集分析主要分为3类，包括生物过程（biological process， BP）、分子功能（molecular function， MF）和细胞组成（cellular component， CC）。

1.6  分子对接验证

利用分子对接模拟软件AutoDock Vina，对可能发挥作用的主要活性成分及处于PPI网络中的核心靶点进行对接模拟计算。在PDB数据库中获得靶点及配体的结构，利用PyMoL和AutoDock Vina软件将其与活性成分分别进行对接。全部对接完成后，根据活性成分和核心靶点最低结合能的数值来评价八珍汤活性成分与靶点的结合能力。

2 结果

2.1  八珍汤活性成分及相关靶点的获取

在TCMSP数据库中以OB≥30%且DL≥0.18为条件进行筛选，获取八珍汤中所含药物的活性化学成分，得到人参有效成分22个、白术7个、茯苓15个、甘草92个、当归2个、熟地黄2个、白芍13个、川芎7个，去重后得到有效成分共150个，部分活性成分见表1。通过TCMSP数据库、UniProt数据库、DrugBank数据库，检索到人参靶点256个，白术23个、茯苓30个、甘草1769个、当归69个、熟地黄34个、白芍123个、川芎42个，去重后共得到230个潜在作用靶点。

2.2  压疮相关靶点获取

从GeneCards数据库获得压疮靶点4882个，根据经验设定Score大于中位数的靶点为疾病潜在靶点，如通过GeneCards所得压疮靶点Score最大值为76.5，最小值为0.15，中位数为2.63，故设定Score>2.63的靶点为压疮的潜在靶点。结合OMIM数据库检索获得的相关靶点，合并后删除重复值，最终得到1496个压疮相关靶点。

2.3  交集靶点PPI网络的构建

利用韦恩图工具将八珍汤靶点与压疮靶点取交集，获得二者的交集靶点131个，见图1。将交集靶点上传至STRING数据库，设置可信度≥0.7，得到靶点PPI网络图，并将数据以tsv格式导入Cytoscape 3.7.2软件绘制蛋白关系网络图。网络中共有126个节点 （靶点蛋白）、927条边（PPI），见图2。节点越大，对应的度值越大，度值越大说明越处于网络核心位置。结果表明，处于该PPI网络中心的靶点有AKT1、IL-6、MAPK1、MAPK8、STAT3、VEGFA、EGF、IL-1β等，推测其为八珍汤治疗压疮的重要靶点，见表2。

2.4  中药活性成分-有效作用靶点网络图的构建

运用Cytoscape 3.7.2构建八珍汤活性成分与有效靶点网络，见图3。通过软件计算八珍汤治疗压疮网络的拓扑学参数，从而用来评价活性成分和作用靶点的重要性。结果发现，槲皮素、山柰酚、查尔酮A、柚皮苷、芒柄花素等活性成分可作用于多个靶点，这些成分可能是八珍汤治疗压疮的主要活性成分，见表3。

2.5  靶点功能与通路的富集分析结果

利用DAVID数据库对有效靶点进行GO注释分析，分别选取BP、CC、MF中20个排名最靠前的结果，发现这些靶点BP主要涉及凋亡的负调控、基因表達的正调控、血管生成的正调控、对有机物的应答、对缺氧的应答、对脂多糖的应答、老化等。MF主要涉及酶结合、蛋白质结合、转录因子结合、血红素结合、蛋白质均二聚活性等。CC主要涉及细胞间隙、胞外区和细胞膜、线粒体、细胞核等方面。结果见图4A、4B、4C。

KEGG富集分析出来的信号通路共116条，包括癌症通路、TNF信号通路、HIF-1信号通路、VEGF信号通路、PI3K-Akt 信号通路、Toll样受体信号通路、MAPK信号通路等，选取其中前20条通路将其可视化，见图4D。

2.6  分子对接验证结果

将度值排名前5的药物主要活性成分（槲皮素、山柰酚、查尔酮A、柚皮苷、芒柄花素）与PPI网络中的8个核心靶点（AKT1、IL-6、MAPK1、MAPK8、STAT3、VEGFA、EGF、IL-1β）进行对接，对接最低结合能见表4。可以看出，所有的成分与靶点的最低结合能都小于0，说明二者能够自发结合，最低结合能的数值越小说明成分与靶点蛋白结合的越好。对接结果显示，5个活性成分与8个靶点的最低结合均能小于或者等于-5.0 kcal/mol，说明这些活性化合物与以上靶点结合活性较好，其中quercetin与STAT3的对接效果最好。见图5。

3 讨论

随着老龄化社会的来临，压疮的发病率越来越高，严重影响患者的健康，加重了家属的护理负担和社会的经济负担。中医在压疮的治疗上具有不错的疗效和简便廉验的特点。《外科正宗》云：“气血者，人之所原禀……人之命脉，全赖于此。百病生焉，失此岂能无变，独疮科尤关系不浅。”气血在疮疡的发生发展及转归预后中发挥着重要作用，气血旺盛则不易发病，即使发病也能在正气的冲托和箍束毒邪的作用下，易起、易溃、易敛。气血两虚证是压疮的常见证型之一，气血两虚证除了托毒生肌外，更重要的是需要补足正气，运用中医的各种方法大补气血[17]。八珍汤为气血双补代表方剂，在创伤愈合领域应用广泛，可用于压疮的治疗、促进压疮修复愈合。

本文通过网络药理学方法对八珍汤进行研究，最终找到了150个潜在活性成分，预测了230个潜在靶点。将药物成分靶点与疾病靶点交集后共获得131个八珍汤治疗压疮的有效靶点。在“活性成分-有效靶点”网络图中槲皮素、山柰酚、查尔酮A、柚皮苷、芒柄花素等成分可作用于多个靶点，推测其是八珍汤治疗压疮的主要活性成分。槲皮素是分布广泛的黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化和免疫调节的作用[18]。在伤口治疗方面，槲皮素可通过减少伤口部位过度的炎性反应、提高VEGF和TGF-β1的水平促进创伤修复愈合[19-20]。对于压疮的治疗，研究[21]发现，槲皮素可减少免疫细胞浸润和促炎性细胞因子的产生，并能通过抑制MAPK途径改善缺血再灌注病变的伤口愈合过程，是压疮的潜在治疗剂，可见槲皮素对于压疮等慢性伤口具有促进愈合的作用。Salehi Majid等[22]研究证实，柚皮苷对伤口愈合的过程具有积极作用，可在临床上用于治疗皮肤损伤。Luo Pei[23]发现板栗壳（CMS）对创伤愈合具有促进作用，此作用与山柰酚的抗炎活性有关。亦有实验研究[24]证实，山柰酚是治疗非糖尿病和糖尿病伤口的有效局部伤口愈合剂。这些成分均可能是八珍汤在压疮治疗过程中发挥作用的重要成分。

从PPI网络图中可以看出靶点间存在多种相互作用，AKT1、IL-6、MAPK1、MAPK8、STAT3、VEGFA、EGF、IL-1β等靶点度值较大，可能与压疮的愈合密切相关。结合GO及KEGG结果分析，压疮重要的发生机制为组织缺血缺氧及再灌注损伤，在缺氧条件下，会产生多种促血管生成因子，包括缺氧诱导因子1（hypoxia inducible factor-1， HIF-1）和VEGF。HIF-1包括对氧敏感的HIF-1α和组成性表达的HIF-1β，缺氧时HIF-1α会稳定积累并与HIF-1β二聚化，转移到细胞核中，并激活促血管生成的重要靶基因如VEGF的转录，从而促进血管再生[25-27]。创面伤口血管新生对于改善压疮尤为关键，VEGFA是最主要的VEGF，能促进内皮细胞的增殖和迁移，从而刺激新生血管的生成[28-29]，在创面愈合中具有重要作用。VEGFA表达减弱或降解加速都与创面愈合障碍相关，肖洪玲在大鼠压疮模型造模成功后发现模型组创面肉芽组织中VEGF含量明显降低，提示压疮肉芽组织形成不良可能与此有关[30]。EGF是HIF-1/VEGF通路中重要的靶基因，它是细胞增殖和分化的关键调节剂，能刺激成纤维细胞和角质形成细胞的迁移和增殖以及胶原蛋白的沉积，能促进细胞外基质的增加及伤口的再上皮化从而加速创面愈合。伤口应用EGF能使上皮快速再形成并能减少感染风险[31-33]。八珍汤能上调大鼠创面VEGF的表达水平、促进人皮肤成纤维细胞合成分泌EGF、VEGF等 [11-12]，因此，八珍汤治疗压疮可能通过作用HIF-1/VEGF通路调控新生血管形成，从而改善压疮组织的缺血缺氧状态。AKT1是一种血清素蛋白激酶，它参与调节内皮细胞和血管平滑肌细胞功能，包括细胞生长、迁移、存活和血管形成。STAT3受PI3K/Akt/mTOR的调节，活化后的STAT3可促进血管新生。PI3K/Akt信号通路在促进血管网络重建中也发挥了关键作用，可作为上游通路调控HIF-1、VEGF的表达来诱导血管的生成[34-36]。炎性反应在压疮形成过程中发挥着重要作用，TNF、MAPK信号通路是重要的炎症通路，与压疮的发生发展密切相关[37-38]。压疮创面中IL-1β、IL-6、TNF-α的表达高于正常皮肤组[39]，创面处于慢性炎症状态不利于组织修复愈合。八珍汤中多种成分均有抗炎作用，槲皮素能通过抑制MAPK通路激活来调节炎症反应，发挥对压疮的治疗作用，提示八珍汤可能通过调节炎症反应促使压疮由炎症期向增殖期转化，从而促进创面愈合。研究表明，细胞凋亡是压疮发生、发展过程中的关键性因素[40-41]，PI3K/Akt信号通路是调控细胞凋亡的重要途径。韩超[42]提出PI3K/Akt信号通路的激活对压疮缺血再灌注损伤的组织具有保护作用，当组织细胞发生缺血再灌注损伤时，活化的Akt可防止细胞凋亡。王晴[43]也通过实验研究证实，局部低温能通过作用于PI3K/Akt/GSK3β信号通路提高Akt和GSK3β的磷酸化水平，抑制凋亡因子Caspase-3激活以及细胞色素C释放从而调控细胞凋亡、减轻大鼠压疮损伤。KEGG通路结果显示，多个基因富集于PI3K/Akt信号通路，该信号通路是八珍汤治疗压疮的重要通路之一，因此八珍汤可能通过激活该通路抑制细胞凋亡从而改善压疮组织的损伤。

本研究以八珍汤为研究对象，通过网络药理学方法，对八珍汤治疗压疮的潜在作用靶点及作用机制进行了研究，推测八珍汤通过槲皮素、柚皮苷、山柰酚等成分发挥作用，通过作用AKT1、IL-6、MAPK1、MAPK8、STAT3、VEGFA、EGF、IL-1β等靶点影响PI3K/Akt、HIF-1/VEGF、MAPK、TNF等信号通路进而促进内皮细胞及血管的生成、调节炎症反应、抑制细胞凋亡以促进压疮愈合。后期可对其进行实验验证，为明确其作用机制和药物的推广应用提供更高等级的循证证据。

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〔收稿日期〕2021-06-19

〔基金项目〕国家中医药管理局中医药行业科研专项（2015468001）;中医药继续教育导航工程-继教专委会建设及精品课程制作。

〔作者简介〕陆海艳，女，在读硕士研究生，研究方向：中医药治疗慢性创面。

〔通信作者〕*代红雨，男，博士，教授，主任医师，硕士研究生导师，E-mail：dhy515@163.com。