杜梨组培苗两步生根技术体系优化

赵亚楠 张 懿 谭 旭 王胜男 姜 峰 李天忠 朱元娣

(中国农业大学 园艺学院，北京 100193)

杜梨(PyrusbetulifoliaBunge)属蔷薇科(Rosaceae)梨属(PyrusL.)多年生落叶乔木，是我国北方地区梨树的优良砧木，用杜梨嫁接的梨树具有适应性强、耐盐碱、抗寒、抗旱、根系发达、生长速度快和能保持梨品种原有风味不变等优点[1]。杜梨以播种繁殖为主，实生后代遗传变异性大[2]，影响接穗品种的生长势和早熟性。目前，杜梨无性系繁殖主要包括扦插和组织培养[3-4]。与扦插繁殖相比，组培繁殖不受季节限制，良好的微繁殖技术体系一旦建立，种苗繁殖系数高，是无病毒种苗繁育的必经之路，亦是果树种苗工厂化生产的有效途径[5]。

梨离体繁殖技术始于20世纪后期[6-8]，国外最早报道见于1979年梨砧木OH×F51[7]和‘巴梨’品种[8]，同期在国内开始‘锦丰’和‘早酥梨’的茎尖培养[9]。至今已建立‘库尔勒香梨’[10]、‘京白梨’[11]、‘津香蜜’和‘巴梨’[12]等多个梨品种和梨矮化中间砧S2、S5和PDR54[13]等砧木的组培繁殖体系。组培繁殖体系包括无菌外植体建立、启动培养、增殖培养和驯化移栽4个环节。试管苗生根移栽是组培繁殖的关键技术，生根质量影响移栽的成活率[14]。梨组培苗离体生根能力除受外植体基因型、继代次数[4]和组培苗生长状态等因素影响以外，还取决于生根诱导方式、培养基成分和培养条件等因素[15]。“两步生根法”多用于难生根的果树材料，如樱桃[16]、梨[17]和桃[18]等。梨不同基因型需要不同的生根诱导培养基。西洋梨在MS(Murashige & Skoog)培养基上比在QL(Quoirin & Lepoivre Medium)培养基容易生根[19]，梨矮化砧木S2、S5和PRD54生根的基础培养基分别以1/2QL、1/2MS和1/4MS为佳[13]。生长素类物质是梨组培苗生根诱导的主要生长调节剂，常用的生长素有吲哚乙酸 (IAA)、吲哚丁酸(IBA)和萘乙酸(NAA)，不同品种植物适宜的生长素种类和浓度不同[20]，常以不同生长素组合来诱导梨不定根的发生[21]。组培苗驯化移栽是梨繁殖的关键环节，不同炼苗方式影响试管苗移栽成活率。未经驯化将组培苗直接移植于田间，组培苗的成活率很低[22]。目前梨组培苗常用的驯化炼苗方法是先闭瓶炼苗再开瓶炼苗[23]。水培炼苗也是一种常见的炼苗方式，其方法是将组培苗置入改良的霍格兰德(Hoagland)营养液中，室内水培驯化，该方法极大地提高苹果和葡萄试管苗移栽成活率[24-25]。

果树无性系砧木是现代果园生产的基础，苹果、西洋梨和樱桃等无性系砧木在欧美国家广泛应用[26-28]。我国新建果园逐步采用苹果和樱桃无性系，但梨无性系砧木应用少，梨试管苗生根诱导和驯化移栽体系有待优化[5]。本研究以杜梨组培苗为试材，研究培养过程中MS、1/2MS、木本植物用培养基 (WPM)和NN69(Nitsch & Nitsch Medium)基本培养基对杜梨生根、不定根诱导阶段的最适激素配方以及闭瓶炼苗和水培炼苗对杜梨生长的影响，旨在解决杜梨组培苗生根率和移栽成活率低的问题，以期为梨组培技术的商品化应用和优质种苗生产提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试植物材料为课题组保存的杜梨组培苗。选取继代培养40～60 d，2.5 cm≤高度≤4.0 cm，粗度≥2 mm，生长健壮的杜梨组培苗进行生根诱导试验。

1.2 试验方法

参照刘永富[3]的暗培养结合“两步生根法”进行杜梨组培苗生根培养。第一步诱导不定根原基，选用健壮组培苗，接种在含有单一生长素或2种生长素组合的培养基上，暗培养7 d；第二步诱导不定根生长，将组培苗转接于不含生长素的相同培养基上，光照培养，采用混合光(红∶蓝∶白=3∶1∶1)，光照强度为2 000～2 500 lx，光周期为14 h/10 h，温度为(25±2) ℃，湿度为40%～50%。

光照培养30 d后，统计杜梨组培苗的生根率和根长≥1 mm的生根数。生根率=生根株数/接种株数×100%；平均生根数=生根条数/生根株数。

1.2.1不定根原基诱导的激素配方设置

以添加15 g/L蔗糖的1/2MS培养基为基础培养基，设置4种激素配方诱导不定根的发生：(A)添加IAA 1.0 mg/L；(B)添加IBA 1.0 mg/ L；(C)添加IAA 1.0 mg/L+IBA 1.0 mg/L；(D)添加IAA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L。采用去除生长素的相同培养基进行不定根生长培养。各处理接种15株，重复3次。

1.2.2生根诱导的基本培养基

以1.2.1中确定的适合杜梨组培苗不定根诱导的激素配方和15 g/L蔗糖为基准，将MS、1/2MS、WPM和NN694种培养基交叉组合，分别进行不定根诱导和不定根生长培养，共设计16种处理(标记为1～16)。各处理接种9株，重复3次。

1.2.3试管苗的驯化移栽

在杜梨组培苗生根30 d后，采用2种方式炼苗。闭瓶炼苗方法是将生根的试管苗移至温室内，闭瓶炼苗3周，在移栽前1 d拧松瓶盖，但不拿掉瓶盖。水培炼苗参照谢璇等[24]的方法，将生根的试管苗从组培瓶中取出，洗去培养基，置于改良Hoagland半营养液中水培3周，每周更换1次营养液。

炼苗3周的试管苗在温室中移栽。按照V(营养土)∶V(草炭)∶V(蛭石)=2∶1∶1配制栽培基质，用800～1 000倍多菌灵溶液进行基质杀菌，基质湿度80%左右。移栽后，立即覆膜保湿。移栽2周后逐渐进行通风降湿，待组培苗叶片不再萎蔫时完全去除覆盖材料。

1.3 数据分析

使用Microsoft Excel 2010软件进行数据整理，使用IBM SPSS Statistics 21软件进行显著性分析，采用Duncan新复极差法进行多重比较，差异显著性水平为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 杜梨组培苗不定根原基诱导的激素配方

“两步生根法”的不定根诱导阶段使用不同的生长素配方对杜梨组培苗生根的影响显著，结果如表1 所示。单独添加IAA的培养基中，组培苗的愈伤组织少(图1(b))，少数植株生根，生根率为(8±7)%，平均生根数为(1.00±1.00)条；单独添加IBA的培养基中，组培苗的愈伤组织较少(图1(c))，生根率为(84±6)%，平均生根数为(2.39±0.09)条；IAA和IBA组合中组培苗产生的愈伤组织较多(图1(d))，生根效果较差，生根率为(67±11)%，平均生根数为(2.90±0.68)条；IAA和NAA组合中组培苗愈伤组织较少(图1(e))，生根效果最好，生根率为(90±2)%，平均生根数为(3.58±0.89)条。综上，在4种激素配方中，IAA 1.0 mg/L和NAA 1.0 mg/L 2种生长素组合最适合在根原基诱导阶段对杜梨组培苗进行生根诱导。

表1 不同生长素配方对杜梨离体生根的影响Table 1 Effect of different auxins combination on in vitro rooting of Pyrus betulifolia

(a)生根诱导的健壮组培苗；(b)吲哚乙酸1.0 mg/L；(c)吲哚丁酸1.0 mg/L；(d)吲哚乙酸1.0 mg/L+吲哚丁酸1.0 mg/L；(e)吲哚乙酸1.0 mg/L+萘乙酸1.0 mg/L(a) Robust shoots used for rooting induction; (b) IAA 1.0 mg/L； (c) IBA 1.0 mg/L； (d) IAA 1.0 mg/L+IBA 1.0 mg/L； (e) IAA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L图1 不同生长素配方对杜梨离体生根的影响Fig.1 Effects of different auxins combination on in vitro rooting of Pyrus betulifolia

2.2 杜梨组培苗生根诱导的基本培养基筛选

不同基本培养基组合对杜梨组培苗生根的影响显著。将MS、1/2MS、WPM和NN694种培养基交叉组合后的生根情况如表2所示。处理1即不定根根原基诱导阶段和不定根生长阶段都采用MS培养基的生根率和生根数最低，分别为(52±17)%和(1.52±0.43)条，与其他处理组差异较大，说明MS培养基不适宜杜梨组培苗的生根；处理16即两阶段都采用NN69培养基的生根率和生根数最高，分别为(96±6)%和(3.28±0.28)条，杜梨组培苗生根快且根数多，生根效果最好。因此，在4种供试基本培养基中，NN69是最适合杜梨组培苗生根的基础培养基。

表2 不同基本培养基对杜梨离体生根的影响Table 2 Effect of different basic media on in vitro rooting of P.betulifolia

(a)～(d)分别代表第一步使用MS、1/2MS、WPM和NN69培养基，第二步采用NN69培养基的生根状态。(a)- (d) The rooting status was represented by MS, 1/2MS, WPM and NN69 medium in the first step and NN69medium in the second step, respectively.图2 杜梨在不同基本培养基上的离体生根状态Fig.2 In vitro rooting status of P.betulifolia on different basic media

2.3 不同炼苗方式对杜梨组培苗生长的影响

杜梨组培苗生根30 d后，进行闭瓶炼苗和水培炼苗3周。组培苗皆有叶片变大，叶色变绿，茎木质化程度提高的现象。闭瓶炼苗中组培苗根长略有增加，无新根发生(图3(c))；水培炼苗中约一半植株有新根或侧根发生(图3(e))。

(a)闭瓶炼苗；(b)水培炼苗；(c)闭瓶练苗后杜梨组培苗的生长状态；(d)水培练苗前的杜梨组培苗的生长状态；(e)水培练苗后的杜梨组培苗的生长状态。(a) Plantlet hardening in closed jars; (b) Plantlet hardening in hydroponic culture; (c)The growth state of in vitro plantlets of P.betulifolia after hardened in closed jars; (d) The growth state of in vitro plantlets of P.betulifolia before hardened in hydroponic culture; (e) The growth state of in vitro plantlets of P.betulifolia after hardened in hydroponic culture.图3 闭瓶炼苗与水培炼苗对杜梨组培苗生长的影响Fig.3 Effects of plantlet hardening in closed jars and hydroponic culture on the growth status of in vitro plantlets of P.betulifolia

杜梨组培苗闭瓶炼苗后移栽163株，移栽1个月成活149株，成活率为91.4%；水培炼苗后移栽94株，1个月后成活85株，成活率90.4%。杜梨组培苗以闭瓶炼苗和水培炼苗方式进行炼苗后的移栽成活率没有明显差异，皆达到90%以上。与水培炼苗相比，闭瓶炼苗适用于大规模的生产应用。综合杜梨组培苗生根培养和驯化移栽的关键技术，建立了杜梨组培苗快速出苗技术流程(图4)。

3 讨 论

图4 杜梨试管苗快速出苗技术流程图Fig.4 The flow chart of the rapid propagation technique of in vitro cultured P.betulifolia

植物组培苗生根诱导过程中，低糖低盐培养基有利于多数植物试管苗生根。蔗糖浓度不适会引起异养无根苗的饥饿或渗透压低于或超出最适水平从而不利于生根，低盐培养基可能是因为培养基中的氮源降低到了一个有利水平而有利于试管苗生根[15]。本研究发现，低盐培养基1/2 MS、WPM和NN69比高盐培养基MS适合杜梨组培苗的生根培养，又以NN69的生根效果最好，可能因为NN69培养基的成分更适合杜梨组培苗不定根的生长。生长素类物质是梨微繁殖中不定根诱导所必需的，常用IAA、IBA和NAA诱导生根。IAA在根原基诱导阶段起着至关重要的作用，王金祥等[29]通过测量根原基诱导阶段IAA含量升高，而生根后IAA含量下降，证明IAA是启动不定根形成的重要因子。IBA比IAA稳定，它可以刺激嫩叶和嫩芽形成的IAA运至基部，从而促进生根，也可以在辅酶的作用下转化成为IAA发挥作用[29-30]。NAA不直接参与根的形成，它可以促进组培苗储存的淀粉水解成为还原糖，有利于不定根的形成，但是NAA浓度过高诱导的愈伤组织过大，不利于后期的移栽成活[31]。生长素单一使用或2种以上混合使用，对不同品种梨生根的作用不同。本研究中，杜梨组培苗单独使用1.0 mg/L IBA的生根效果较好，与已有报道中IBA诱导梨组培苗生根的结果一致[20]，但IAA和IBA各1.0 mg/L混合处理，却抑制了杜梨组培苗生根。使用1.0 mg/L IAA和1.0 mg/L NAA的组合时，杜梨组培苗的生根率和生根数最高，说明合适的生长素组合共同诱导杜梨组培苗生根效果优于单一生长素处理。不定根诱导过程中暗培养时间受繁殖体生长状态、继代繁殖次数和培养环境等因素影响。本研究选择暗培养7 d，产生的愈伤组织不影响组培苗的生根和移栽成活率。短时间暗培养如2 d不利于杜梨生根[3]。

除了通过优化生根过程来提高组培苗的生根率和生根数以外，合适的炼苗方法也是提高组培苗移栽成活率的重要措施[19]。梨的炼苗是通过不断降低湿度完成的[32]。本研究采用闭瓶炼苗和水培炼苗2种方式，组培苗地上部分生长状态相似，但水培炼苗的根系发育优于闭瓶炼苗，这与在苹果[24]、葡萄[25]和香蕉[33]上的研究结果一致。水培炼苗可以提高移栽后香蕉苗的根系活力和光合效率，加快植株生长[33]，故水培炼苗是否会对杜梨组培苗的后续生长产生有益影响，有待进一步研究。梨组培苗常用的炼苗方法是先闭瓶炼苗再开瓶炼苗，闭瓶炼苗主要是增强叶片对光照强度的适应性，开瓶炼苗能进一步提高叶片对湿度降低引起的水分胁迫的适应性[29]。因为杜梨组培苗极易失水萎蔫，所以本研究中直接采用闭瓶炼苗，移栽后立即覆膜保湿，杜梨组培苗易成活。本研究采用2种方式炼苗3周后，杜梨组培苗的移栽成活率没有明显差异，这可能与组培苗的生长状态有关。当组培苗足够健壮，根系质量好，无论采用何种炼苗方式皆能获得较高的移栽成活率，而闭瓶炼苗更易于生产应用。

4 结 论

本研究通过对杜梨组培苗培养过程中培养基配方的筛选发现“低盐低糖高浓度生长素的培养基+暗培养”诱导不定根发生和“低盐低糖无激素培养基+光照培养”促进不定根生长的“两步生根法”适宜杜梨组培苗生根培养。驯化移栽过程中通过对闭瓶炼苗和水培炼苗2种方式的比较分析发现，闭瓶炼苗3周后以V(营养土)∶V(草炭)∶V(蛭石)=2∶1∶1为栽培基质，移栽温室后驯化1个月组培苗成活率达90%以上。