减肥类保健食品中非法添加物快速测定分析

胡飞杰，王 迪，余恒琳，朱毛毛，徐 宁，王超璠，戴彩霞

（南京市产品质量监督检验院，江苏 南京 210019）

近些年减肥类保健食品热销，面对巨大的市场和利益的诱惑，一些不法厂商为了追求疗效，在保健食品生产过程中盲目添加一些非法添加药物［1-2］。西布曲明最早是用于治疗抑郁症的药品，后来无意中被发现其减重作用更强，于是被药企用于减肥药研发［3］。长期过量或滥用西布曲明可使血糖升高，血钾降低，会引起厌食、内分泌紊乱、心律不齐、高血压、神经系统损伤、肝功能异常等不良症状，后果非常严重［4-6］。储蓉等［7］通过对84批减肥类保健食品中非法添加化学物质的数据分析发现：减肥类保健食品中非法添加的化学物质以盐酸西布曲明、酚酞比较常见。减肥类的保健食品近几年检出率较高的添加的违禁药物还有盐酸西布曲明衍生物等［8-10］。

目前有很多关于减肥类保健食品中盐酸西布曲明和酚酞的检测方法的研究，主要的检验方法有液相色谱法［11］、气相色谱-质谱联用法［12］、液相色谱-质谱联用法［13］、离子迁移谱法［14］等。质谱虽然检测灵敏度高，但也有弊端。据有关报道，不法商贩是凭感觉随意添加西布曲明等非法添加药物，一旦检出，其含量就比较高［15］，直接进气相色谱质谱或液相色谱质谱联用仪，仪器极易污染，而质谱仪器价格昂贵，成本明显增高。若多次稀释再进质谱，则会造成误差大定量不准确。涂凤莲等［16］利用液相色谱测定西布曲明及其两种衍生物、酚酞，检测分析时间较长，色谱峰的分离度不好。减肥类中成药和保健食品补充检验方法和检验项目批准件2012005［17］中，液相色谱仪器条件表述不明确，且很少对液相色谱法进行优化，色谱峰有拖尾现象。本研究针对检出率较高的盐酸西布曲明、盐酸N-单去甲基西布曲明、盐酸N，N-双去甲基西布曲明和酚酞这四种物质建立高效液相色谱法。对液相色谱仪器参数进行优化，筛选出最佳色谱仪器条件，并利用光谱进行确证。另外还对液质色谱法中离子对进行优化，选用3～4离子对进行校验，进一步提高液质色谱确证的准确度。从技术方面进行突破，为市场监管节约时间与成本，对保证保健食品的质量安全具有非常重要的意义。

1 仪器与试剂

1.1 试验仪器

1260-液相色谱仪（美国安捷伦公司）；6470-液相色谱-质谱仪（美国安捷伦公司）；KQ-500DE型-数控超声波（昆山市超声仪器有限公司）；IKA Vor⁃tex2-涡旋仪器（德国IKA公司）；Milli-Q-超纯水仪（默克化工技术（上海）有限公司）；SQP-电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司公司）；TDZ5-台式低速离心机（湖南赫西仪器装备有限公司）。

1.2 试验材料与试剂

两种不同剂型市售的声称减肥类保健品。

胶囊剂产品名称：美林康牌左旋肉碱绿茶胶囊，生产厂家：威海南波湾生物技术有限公司，产品批号：A03200915A。

茶剂产品名称：碧生源®牌常菁茶，生产厂家：北京澳特舒尔保健品开发有限公司，产品批号：04200602。

超纯水，乙腈、甲醇（色谱级，上海安普科技股份有限公司），乙酸（≥99.5%，分析纯，上海泰坦化学有限公司），乙酸铵（≥98.0%，特优级，上海泰坦化学有限公司）；标准物质：酚酞（99.8%，北京曼哈格生物科技有限公司）、盐酸西布曲明（99.5%，中国食品药品检定研究院）、盐酸N-单去甲基西布曲明（99.4%，北京曼哈格生物科技有限公司）、盐酸N，N-双去甲基西布曲明（98.9%，北京曼哈格生物科技有限公司），见表1。

表1 4种非法添加物的基本信息Table 1 Basic information of four illegal additions

2 研究方法

2.1 样品的制备

减肥胶囊：取20粒胶囊内容物充分混匀；减肥茶：取20 g袋装茶充分混匀；精密称取混匀的样品1.0000 g，于25 mL容量瓶中，加15 mL甲醇，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放置室温，用甲醇定容至刻度，摇匀后离心，取上清液，即得。

2.2 标准溶液配制

2.2.1 标准储备液

分别精密称取盐酸西布曲明、盐酸N-单去甲基西布曲明、盐酸N，N-双去甲基西布曲明、酚酞4种标准品置于10 mL棕容量瓶中，加入5 mL甲醇，超声溶解20 min，放冷至室温，用甲醇定容至刻度，涡旋混匀，配置成1.0 mg/mL的标准储备液，于-20℃冰箱中保存。

2.2.2 混合标准中间液

吸取标准储备液200μL置于10 mL棕容量瓶中，用甲醇稀释配置成混合标准中间液。其中四种物质的浓度均为200.0μg/mL，于4℃以下冰箱中保存。

2.2.3 混合标准工作液

精密吸取2.2.2的混合标准中间液用甲醇稀释至样品检测的浓度。标准曲线的最终浓度为5.0、10.0、2 0.0、50.0、100.0μg/mL。

2.3 色谱仪器条件的单因素实验

影响液相色谱出峰时间、峰形和分离度的因素主要有色谱柱种类、柱温、流动相配比和流速等。通过单因素分别考察色谱柱种类、柱温、流动相配比和流速对四种非法添加物的分离效果和峰形的影响。色谱柱对分离效果和峰形的影响：分别使用Agilent Eclipse Plus C18（5μm，4.6×250 mm）和GL Sciences Inc.InertSustain C18（5μm，4.6×250 mm）对盐酸西布曲明等4种物质进行分离效果的比较；色谱柱柱温对分离效果和峰形的影响：考察不同柱温（25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃）对4种非法添加物质分离效果；流动相不同配比对分离效果和峰形的影响：流动相A，乙腈；流动相B，0.02 mol/L乙酸铵水溶液（用乙酸调pH至4.0±0.2），比较不同流动相配比B：A为41：59、44：56、47：53、50：50、53：47的分离效果；流速的选择对分离效果和峰形的影响：流速分别选择0.5、0.8、1.0、1.2 mL/min四个流速进行比较。

2.4 质谱色谱条件

液相条件：色谱柱，InertSustain C18（2μm，2.1 mm×100 mm）；柱温40℃；进样体积5.0μL；流动相A为0.01 mol/L乙酸铵（0.1%甲酸），B为乙腈；流速0.3 mL/min。洗脱梯度见表2。酚酞、盐酸N，N-双去甲基西布曲明、盐酸N-单去甲基西布曲明、盐酸西布曲明在正离子模式下进行全扫面和单离子扫描得到母离子并优化碎裂电压，使母离子的丰度达到最优，再进行子离子扫描。选择3～4个特征碎片离子对，优化相对应的碰撞电压，并选取丰度相对较高的子离子作为定量离子。

表2 梯度洗脱程序Table 2 Gradient elution procedure

2.5 方法学考察

标准曲线的绘制：以标准品质量浓度（X，μg/mL）为横坐标，以峰面积（Y，mAu×s）为纵坐标绘制标准曲线。

重复性试验和回收试实验：选取减肥胶囊，减肥茶的空白基质样品，每种样品称1 g，分别添加低、中、高3个水平混合标准溶液，每个添加水平测定做6次平行实验。

3 试验结果

3.1 液相色谱条件的优化

3.1.1 色谱柱的选择

在同一流动相条件下，Agilent Eclipse Plus C18色谱柱上4种物质均能实现很好的分离，而且峰形更尖锐，灵敏度更高，比补充检测方法［18］中峰分离度更好。而在GL Sciences Inc.InertSustain C18的条件下，酚酞和盐酸N，N-双去甲基西布曲明完全重合成一个峰，分离效果很差，且峰宽都较大，有拖尾现象。因此，选择Agilent Eclipse Plus C18（5μm，4.6×250 mm）作为分离色谱柱，4种物质的高效液相色谱图见图1。

3.1.2 色谱柱柱温的选择

柱温升高可以降低流动相粘度、提高传质效率、缩短分析时间，但温度太高影响色谱柱的使用寿命。由于4种物质中酚酞、盐酸N，N-双去甲基西布曲明、盐酸N-单去甲基西布曲明分离效果并不理想，因此考虑温度对分离度的影响。实验发现，同一色谱条件下，随着温度的升高，酚酞、盐酸N，N-双去甲基西布曲明和盐酸N-单去甲基西布曲明的分离度越来越好。但是当温度达到55℃时，基线波动开始增大，在浓度较低时对检测结果有影响，因此选择50℃的柱温，分离效果最好，基线最稳，图谱见图1。

3.1.3 流动相配比选择

试验比较流动相A，乙腈；流动相B，0.02 mol/L乙酸铵水溶液（用乙酸调pH至4.0±0.2）不同配比分离效果。当乙腈比例为44时，4种物质集中在一起，无法分离。随着乙腈比例的增大，4种物质的分离度逐渐增大。当流动相B：A比例为47：53等度洗脱时，此条件下4种物质明显分开，分离度增大，且出峰时间稳定。最终选择乙酸铵水溶液：乙腈为47：53，图谱见图1。

图1 225 nm下酚酞、盐酸N，N-双去甲基西布曲明、盐酸N-单去甲基西布曲明、盐酸西布曲明的高效液相色谱图Fig.1 UPLC chromatogram of phenolphthalein，N-didesmethyl sibutramine hydrochloride，didesmethyl sibutramine，sibutratmine hydrochloride monohydrate

3.1.4 流速的选择

流速分别选择四个不同流速进行试验，发现流速为0.5 mL/min、0.8 mL/min时4种物质出峰顺序为盐酸N，N-双去甲基西布曲明、酚酞、盐酸N-单去甲基西布曲明、盐酸西布曲明，酚酞出峰在两种衍生物出峰中间且峰与峰相互连接，分离度不好液相色谱难以定量。当流速为1.0 mL/min时4种物质出峰顺序为酚酞、盐酸N，N-双去甲基西布曲明、盐酸N-单去甲基西布曲明、盐酸西布曲明，酚酞最先出峰且4种物质明显分开，分离度增大。当流速为1.2 mL/min时4种物质虽都能分开但分离度不如1.0 mL/min时，所以流速选择1.0 mL/min。

3.1.5 色谱峰的定性

酚酞、盐酸N，N-双去甲基西布曲明、盐酸N-单去甲基西布曲明、盐酸西布曲明的高效液相色谱最大吸收波长见图2。通过将样品图谱与4种非法添加药物标准品的光谱比对进行排除杂质的干扰进行确证。

图2 酚酞、盐酸N，N-双去甲基西布曲明、盐酸N-单去甲基西布曲明、盐酸西布曲明的高效液相色谱光谱图Fig.2 Wavelength spectrograms of phenolphthalein，N-didesmethyl sibutramine hydrochloride，didesmethyl sibutramine，sibutrat⁃mine hydrochloride monohydrate on photodiode array detector

3.2 线性关系、方法检出限及定量限

配制系列的混合标准溶液，得到线性回归方程。结果表明，各目标化合物在线性范围内线性关系良好；配制标准溶液混标，用空白基质溶液稀释到适量浓度，以仪器3倍和10倍性噪比确定方法检出限和方法定量限，结果见表3。

表3 4种非法添加物的线性关系Table 3 Linear relationship of four illegal additions

3.3 重复性和回收率

重复性和回收率试验结果见表4。结果表明，三个不同添加水平的回收率在80.4%～104.6%，相对标准偏差在0.7%～9.5%，都控制在10%以内。说明该方法具有良好的准确度和精密度。均符合GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》中要求。

表4 4种非法添加物不同浓度添加水平回收率结果Table 4 Recovery results of four illegal additions at different concentrations

3.4 用液质方法进行确证

质谱参数：AJS-ESI电离源，正离子电离模式，监测模式：MRM。通过对4种非法添加物的离子对优化得到的多反应监测质谱参数见表5。液相中确认有非法添加物后，再通过液质仪器与标准物质的定量离子和定性离子进行对比，若定量离子和定性离子与标准物质一致，则该样品确认含有该非法添加物。参考图谱见图3和图4，分别为4种化合物的总离子流图、定量离子和定性离子图。

表5 4种非法添加物多反应监测质谱参数Table 5 Multi reaction monitoring mass spectrum parameters of four illegal additions

图3 酚酞、盐酸N，N-双去甲基西布曲明、盐酸N-单去甲基西布曲明、盐酸西布曲明的总离子流图Fig.3 Total ion current diagram of phenolphthalein，N-didesmethyl sibutramine hydrochloride，didesmethyl sibutramine，sibutrat⁃mine hyclrochloride monohydrate

图4 酚酞、盐酸N，N-双去甲基西布曲明、盐酸N-单去甲基西布曲明、盐酸西布曲明的多反应监测质谱叠加图及离子对比图Fig.4 MRM mass spectrogram stack and ion contrast diagram of phenolphthalein，N-didesmethyl sibutramine hydrochloride，dides⁃methyl sibutramine，sibutratmine hydrochloride monohydrate

3.5 实际样品分析

按照本研究中液相色谱法对市售30批次减肥类保健品进行分析，其中3批次检测出与盐酸西布曲明色谱峰出峰时间一致，对比液相光谱图确定为盐酸西布曲明，其含量极高，进一步稀释样品进行液质核对，此3批次确为盐酸西布曲明。该方法可用于实际减肥类保健食品样品的快速定性定量，大大提高了检测效率。

4 讨论

经过近两年的保健食品检测，减肥类保健品中检出率较高的非法添加为酚酞和西布曲明及其衍生物，监督部门需要重点关注。本研究建立了一种利用高效液相色谱技术于15 min内同时检测酚酞、盐酸N，N-双去甲基西布曲明、盐酸N-单去甲基西布曲明、盐酸西布曲明的检测方法，并优化了质谱方法中的离子对。从研究试验数据可以看出，各物质成分的线性关系良好，回收率均较高，展现出了分离能力强，灵敏度高，分析速度快，定量分析准等优点，可用于减肥类保健食品中非法添加化学药物的定性筛查和定量检测，为保健食品中减肥类非法添加监管提供检测技术。然而本研究是一次性检测4种物质，检测物质数量稍少，今后的研究将增加检测物质的数量，往高通量检测方向上开展研究。