基于UHPLC-Orbitrap-MS/MS法分析青蒿鳖甲汤化学成分

韩鑫龙，成 欣，孙颖超，李雨桐，杨加顺，张静莹，唐 玲*

(1.大连大学生命科学与技术学院，辽宁 大连 116622；2.南方医科大学中医药学院，广东 广州 510515；3.大连三仪动物药品有限公司，辽宁 大连 116036；4.南方医科大学第三附属医院，广东 广州 510630；5.广东医科大学第二临床医学院，广东 东莞 523808；6.广东省中药制剂重点实验室/广东省中药制剂技术工程实验室，广东 广州 510515)

青蒿鳖甲汤，最早出现于清代叶天士《临证指南医案·卷五·温热·热陷血分王案》，后在温病学家吴鞠通著的《温病条辨·卷三·下焦篇·风温》条文十二中又有记载。其药方为青蒿、鳖甲、细生地、知母与丹皮，此方相比叶天士的来看，去淡竹叶，规范了用量，使方证配伍更为严谨切合，并冠以方名做出方论，青蒿鳖甲汤就是由此而来[1]。

青蒿鳖甲汤广泛应用于临床各科发热症候的病症治疗，除此之外对恶性肿瘤、泌尿系统疾病、更年期综合征等也有较好的疗效[2]。有关这一方剂的化学成分分析较为鲜见。因此，探明其化学成分对其药效物质基础、质量控制方向上有重要意义[3]。

近年来，超高效液相色谱-高分辨质谱联用技术凭借其高分辨、高精度等优点在天然产物的鉴定中得到了广泛的应用。本研究利用超高分辨三合一质谱仪对青蒿鳖甲汤的主要化学成分进行快速、全面的结构鉴定，以期为该方药效物质基础及质量控制提供理论支持。

1 材料

1.1 仪器 液质联用系统(美国Thermo Fisher公司)，包括高效液相色谱仪、自动进样器、柱温箱、二元泵、质谱；CPA225D电子分析天平(德国赛多利斯公司)；JP-080ST超声波清洗器(深圳市洁盟清洗设备有限公司)；旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)。

1.2 试剂与药物 青蒿、鳖甲、生地、知母、丹皮饮片购于康美药业有限公司。甲醇(色谱纯，德国Merck公司)、屈臣氏蒸馏水(广州屈臣氏食品饮料有限公司)，其余试剂均为分析纯。脯氨酸(批号140677-201507)、梓醇(批号110808-201210)、芍药苷(批号110736-200934)、青蒿素(批号1201016-201004)、夏佛塔苷(批号111912-201703)、东莨菪内酯(批号110768-200504)、藁本内酯(批号111737-201001)对照品均购自中国食品药品检定研究院，纯度≥98%。

2 方法

2.1 溶液制备

2.1.1 供试品溶液 称取青蒿18 g、鳖甲45 g、细生地36 g、知母18 g、丹皮27 g，共144 g。鳖甲加450 mL水煎煮1 h，过滤后加入450 mL水煎煮45 min，同时将其他药材浸泡45 min。将两次鳖甲煎煮液和其他药材混合，微沸煮1 h，得到总体积约1 000 mL，浓缩约至275 mL，冻干保存。取冻干粉0.050 4 g，溶于10 mL甲醇中，超声溶解5 min后过0.22 μm微孔滤膜，即得，质量浓度约为5 mg/mL。

2.1.2 对照品溶液 精密称取对照品粉末于10 mL量瓶中，甲醇溶解稀释至刻度，摇匀，制得对照品储备液，取50 μL，甲醇稀释至1 mL，即得。

2.2 色谱条件 Hypersil gold C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.9 μm)；流动相0.2%乙酸(A)-甲醇(B)，梯度洗脱(0～6 min，20%～75%B；6～12 min，75%～95%B；12～17 min，95%B)；体积流量0.3 mL/min；进样室温度4 ℃；柱温45 ℃；进样量2 μL。

2.3 质谱条件 ESI源，正负离子检测模式；离子源温度350 ℃，毛细管温度275 ℃；鞘气体积流量40 L/min，辅助气体积流量8 L/min，扫尾气体积流量1 L/min；喷雾电压3 500 V；扫描范围m/z75～1 100。

2.4 数据分析 利用Compound Discoverer3.0软件进行分析，获得误差范围≤5.0×10-6分子式和二级质谱碎裂信息，采用网络数据库Chemspider、Scifinder等进行峰匹配检索。

3 结果

3.1 UHPLC-Orbitrap-MS/MS 青蒿鳖甲汤样品总离子流图中各色谱峰得到了较好的分离，检测时间17 min。

3.2 化学成分鉴定 依据保留时间、高分辨分子量、二级质谱特征碎片，结合数据库检索、文献、对照品对化学成分进行指认，共鉴定出71个化合物，包括有机酚酸类11个、黄酮类10个、萜类10个、香豆素类9个、氨基酸类7个、苷类6个、糖类4个、生物碱类3个、皂苷类3个、环烯醚萜、酯类各2个、苯酞、木脂素、苯丙素、其他类各1个，见表1，总离子流图见图1。以下以峰2、19、24、41、49、59为例，说明分析过程。

表1 青蒿鳖甲汤化学成分分析结果

续表1

图1 青蒿鳖甲汤负离子模式(A)、正离子模式(B)总离子流图

峰2分子离子峰为m/z114.06[M-H]-，其裂解碎片m/z70.06[M-H-HCOOH]-，确定分子式为C5H9NO2。查找数据库以及文献与L-脯氨酸相符，经过对照确定峰2为L-脯氨酸[4-5]。

峰19分子离子峰为m/z362.12[M-H]-，二级质谱产生199.06[M-H-C6H10O5]-、169.04[M-H-C6H10O5-CH2OH]-、151.03[M-H-C6H10O5-CH2OH-H2O]-特征峰，确定分子式为C15H22O10。查找数据库和文献，发现它与梓醇的碎片基本一致，经过对照品比对，推断峰19为梓醇[6-7]，可能的裂解途径，见图2。

图2 梓醇裂解途径

峰24的分子离子峰为m/z433.11[M+H]+，二级质谱中产生342.10[M+H-C3H6O3]+、283.05[M+H-C3H6O3-C2H4O2]+、313.07[M+H-C4H8O4]+特征峰，确定分子式为C21H20O10。查找数据库和文献，发现它与牡荆素的碎片信息基本一致，推断峰24为牡荆素[8-9]，可能的裂解途径，见图3。

图3 牡荆素裂解途径

峰41的分子离子峰为m/z167.06[M+H]+，二级质谱产生149.05[M+H-H2O]+、125.05[M+H-CH2CO]+和121.06[M+H-H2O-CO2]+特征峰，确定其分子式为C9H10O3。查找数据库以及文献，发现它丹皮酚的碎片基本一致，推断峰41为丹皮酚[10-11]，可能的裂解途径，见图4。

图4 丹皮酚裂解途径

峰49的离子峰为m/z584.13[M+H]+，二级质谱中有规律的脱去90、120的产物离子峰，没出现脱糖基的特征离子峰493.09[M+H-90]+、463.08[M+H-120]+、331.04[M+H-90-Glu]+，推测为六碳六氧糖的碳苷类化合物，确定其分子式为C25H28O16。查找数据库和文献，发现它与新芒果苷的碎片基本一致，推断峰49为新芒果苷[12-13]。

峰59的分子离子峰为m/z479.16[M-H]-，碎片离子m/z121.02为苯甲酸分子，确定其分子式为C23H28O11。查找数据库和文献，发现它与芍药苷的碎片基本一致，推断峰59为芍药苷[14-15]，可能的裂解途径，见图5。

图5 芍药苷裂解途径

4 讨论

本实验分别采用C18色谱柱和亲水型色谱柱进行预实验分析，结果发现C18色谱柱的分离效果较好，考虑是由于组方成分复杂造成的亲水型色谱柱分离效果不明显，故选择本文中的Hypersil gold C18型色谱柱进行实验。在梯度优化过程中，发现使用比较缓慢的梯度时，前10 min出峰较少，分离效果不佳，故把梯度条件加快，最终选定了本次文章中所用的实验条件。

本实验采用UHPLC-Orbitrap-MS/MS技术在正负离子模式下对青蒿鳖甲汤样品的化学成分进行分析[3,16-17]，共鉴定了70种化学成分。实验中发现青蒿鳖甲汤中主要含有机酚酸、黄酮、萜类、香豆素类等化学成分，猜测这些成分可能是其发挥药效作用的物质基础。如源自青蒿中的成分青蒿素、青蒿酸、东莨菪内酯具有抗肿瘤、抗炎止痛等作用[18-20]，源自生地中的成分梓醇，具有有抗癌、抗肝炎病毒等作用[21]，源自知母中的菝葜皂苷元具有清热解毒止渴除烦等作用[22]，丹皮中主要成分丹皮酚具有抗炎、解热镇痛和抑制变态反应的作用[23]，鳖甲中含有的多种氨基酸如谷氨酸、脯氨酸等具有调节生理机能、催化代谢等[24]作用。

综上所述，本实验通过UHPLC-Orbitrap-MS/MS技术较全面地分析并鉴别了青蒿鳖甲汤中存在的化学成分及其复方产物[25-26]，填补并丰富了该复方的化学成分信息，为进一步解释青蒿鳖甲汤药效作用提供有力的科学依据，并为下一步寻找其关键活性成分物质奠定了研究基础。同时也可以作为潜在的中药材新资源开发提供参考依据，为其他类似化合物质谱解析提供参考。