复方红景参丸对慢性阻塞性肺炎模型大鼠肺功能的作用及其机制

黄莉容，张馨月，曾 锐，刘明华，孙 琴*

(1.西南医科大学药学院，四川 泸州 646000；2.西南医科大学附属中医医院，四川 泸州 646000)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是常见的慢性呼吸系统疾病，2017新版慢性阻塞性肺病全球倡议，将COPD定义为一种常见的以气流受限和持续性呼吸系统症状为特征的，可以预防和治疗的肺部疾病[1-2]。COPD实质是一种慢性气道炎症性疾病，炎症细胞浸润刺激大量的炎性因子释放，引起黏液分泌增加，同时出现免疫功能异常，尤其是免疫细胞功能紊乱[3]。p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)为应激蛋白激酶，几乎参与生物体内全部的病理、生理过程，特别是氧化应激、炎性反应等，磷酸化的p38MAPK可激活大量转录因子，促进炎性因子等多种基因的表达[4-6]。复方红景参丸为治疗慢性阻塞性肺病的临床经验方，君药为红景天、人参；臣药有麦冬、金钗石斛；佐以丹参制成中药丸剂，具有益气活血，健脾润肺的功效，适用于缺氧亚健康人群。本研究采用烟熏和气道滴入脂多糖(LPS)构建慢性阻塞性肺炎模型大鼠，研究复方红景参丸对COPD模型大鼠肺功能、炎性因子及p38MAPK通路的影响，旨在将复方红景参丸开发为医疗机构制剂，并为临床用于COPD提供科学的实验依据。

1 材料

1.1 试剂与药物 复方红景参丸(工艺路线为红景天、麦冬和石斛水提，人参、丹参打粉)为棕褐色浓缩丸，气微，味微苦，每1 g含红景天苷(C14H20O7)不得少于1.28 mg，含人参皂苷Rg1、Re、Rb1总量不得少于2.02 mg，由西南医科大学附属中医医院制剂室制备，大鼠给药剂量按生药量计算。氨茶碱片(国药集团汕头金石制药有限公司，批号H19021214，规格0.1 g)。白三烯(LTB4)、白细胞介素-6 (IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)酶联免疫吸法ELISA试剂盒及苏木精-伊红(HE)染色液，均购自上海碧云天生物技术有限公司；中华牌香烟(上海烟草集团有限责任公司，含焦油10 mg、尼古丁1.0 mg、烟气一氧化碳量13 mg)；组织蛋白提取试剂，购自南京凯基生物科技发展有限公司；一抗兔抗鼠TNF-α、p38MAPK、p-p38MAPK多克隆抗体，购自美国CST公司；二抗辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，购自北京中山生物技术有限公司。

1.2 动物 SPF级SD大鼠，4～5周龄，雌雄各半，体质量180～220 g，由成都达硕实验动物有限公司提供，实验动物使用许可证号SYXK(川)2018-24，饲养于SPF级动物室中，相对湿度为40%～70%，温度为20～25 ℃，换气次数为10～12次/h,保持12 h/12 h光照循环，自由摄食饮水。

2 方法

2.1 模型建立 60只大鼠适应性饲养1周后，随机分为空白对照组、模型对照组、氨茶碱组及复方红景参丸低、中、高剂量组，每组10只，空白对照组大鼠正常饲养，其余50只通过烟熏和LPS气道滴入法建立COPD模型，每天烟雾暴露2次，每次30 min，烟熏箱规格为60 cm×40 cm×30 cm，每次点燃15支中华香烟，连续处理28 d；于实验起第1、14天，10%水合氯醛(2 mL/kg)腹腔注射麻醉，向气管内注入1 mg/kg LPS[6]。在第2次注射LPS后开始，复方红景参丸低、中、高剂量组每天分别灌胃给予1.17、2.33、3.5 g生药/kg，氨茶碱组灌胃给予160 mg/kg氨茶碱，空白对照组和模型对照组灌胃给予等容量生理盐水，每天1次，连续4周。

2.2 大鼠一般状态观察 观察并记录各组大鼠体质量、呼吸有无咳嗽、气急、喘鸣等情况，摄食量、毛发及其他异常变化。

2.3 大鼠肺功能指标检测 大鼠灌胃给药4周后，腹腔注射10%水合氯醛2 mL/kg麻醉，暴露气管后切开，插入连接有三通管的插管，其另一端与FlexiVent动物肺功能仪相连，待大鼠苏醒后检测用力肺活量(forced vital capacity，FVC)、第0.1秒用力呼气容积(forced expiratory volume in one second，FEV0.1)、呼气峰流速(peak expiratory flow，PEF)[7]。

2.4 大鼠肺泡灌洗液白细胞计数及分类 大鼠腹主动脉采血后撤走三通管，打开胸腔暴露肺脏，将右肺门用手术线结扎，左肺通过插管缓慢注入5 mL生理盐水，洗涤3次，洗涤液离心弃上清，200 μL PBS重悬沉淀，取20 μL悬液，在显微镜下统计白细胞总数。将剩余悬液制成细胞涂片，进行瑞氏-吉姆染色，在显微镜下统计200个细胞中肺泡巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞的数目。

2.5 HE染色 剪取右肺，PBS洗涤后10%中性甲醛固定，脱水，石蜡包埋，HE染色，封片，在光镜下观察，进行组织病理学检测。

2.6 大鼠炎性因子水平检测 肺功能测定完成后，大鼠腹主动脉采血，收集的血液室温放置4 h后离心，取上层血清置于-20 ℃备用。临用前平衡至室温，按照ELISA试剂盒说明书步骤进行操作，检测血清炎性指标LTB4、IL-6、IL-1、TNF-α的水平。

2.7 Western blot分析 肺功能测定完成后，剪下大鼠前叶肺组织，在液氮下冻存备用，实验时取出，加入RIPA裂解液充分研磨后匀浆，提取总蛋白，BCA法检测总蛋白浓度，上样量为50 μg，在80～120 V下进行SDS-聚丙烯凝胶胶电泳，100 V下进行转膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，TBST洗涤后加1∶1 000稀释的一抗(TNF-ɑ、p38MAPK、p-p38MAPK)，4 ℃摇床中孵育过夜，二抗在室温下摇床孵育1 h，TBST洗涤后滴加ECL发光液，在Bio-Rad凝胶成像系统内曝光显影，采用Image Lab 3.0软件对蛋白条带进行分析，计算TNF-ɑ、p38MAPK、p-p38MAPK相对表达，以β-actin为参照蛋白。

3 结果

3.1 复方红景参丸对大鼠一般状态的影响 空白对照组大鼠摄食量、体质量不断增加，无咳嗽，呼吸平静无喘鸣；模型对照组大鼠死亡1只，摄食量、体质量增加不明显，少数甚至减轻，呼吸急促，有咳嗽和喘鸣，活动明显减少；氨茶碱组、复方红景参丸各剂量组大鼠呼吸频率较模型对照组有不同程度的降低，咳嗽、喘鸣减少，状态较活跃，摄食量、体质量均有不同程度的增加。

3.2 复方红景参丸对大鼠肺功能的影响 与空白对照组比较，模型对照组大鼠FVC、FEV0.1、PEF水平均降低(P<0.01)；与模型对照组比较，氨茶碱组、复方红景参丸各剂量组大鼠FVC、FEV0.1、PEF水平均升高(P<0.05，P<0.01)，并呈剂量依赖性。见表1。

表1 各组大鼠肺功能Tab.1 Pulmonary functions of rats in each

3.3 复方红景参丸对大鼠肺泡灌洗液白细胞总数及分类的影响 与空白对照组比较，模型对照组大鼠白细胞总数及巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞数均升高(P<0.05)；与模型对照组比较，氨茶碱组及复方红景参丸高剂量组大鼠白细胞总数及巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞数均降低(P<0.01)，复方红景参丸中剂量组白细胞总数及淋巴细胞、中性粒细胞数降低(P<0.05，P<0.01)，巨噬细胞无明显变化(P>0.05)，复方红景参丸低剂量组中性粒细胞数下降(P<0.05)，白细胞总数及巨噬细胞、淋巴细胞数无明显变化(P>0.05)，见表2。

表2 各组大鼠肺泡灌洗液白细胞计数及分类Tab.2 Counts and classification of white blood cells in bronchoalveolar lavage fluid of rats in each group

3.4 复方红景参丸对大鼠肺组织形态学的影响 空白对照组大鼠支气管壁结构完整，肺泡形态正常，无明显的炎性浸润和腺体增生；模型对照组大鼠支气管壁附着有大量炎性细胞，部分肺泡相互融合增大，肺泡管、细支气管扩张成大型腔状结构，有明显腺体增生；氨茶碱组与复方红景参丸各剂量组大鼠支气管有少量炎性细胞附着，并随着剂量升，炎性细胞附着数量减少，肺泡间隔破坏程度减轻，见图1。

3.5 复方红景参丸对大鼠血清炎性因子的影响 与空白对照组比较，模型对照组大鼠血清LTB4、IL-6、IL-1β、TNF-α水平升高(P<0.01)；与模型对照组比较，氨茶碱组与复方红景参丸各剂量组大鼠LTB4、IL-6、IL-1β、TNF-α水平低(P<0.05，P<0.01)，见表3。

表3 各组大鼠血清LTB4、IL-6、IL-1β、TNF-α水平Tab.3 Serum levels of LTB4,IL-6,IL-1β and TNF-α in rats in each group

3.6 复方红景参丸对大鼠肺组织TNF-α、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表达的影响 与空白对照组比较，模型组大鼠肺组织TNF-α、p-p38MAPK蛋白表达升高(P<0.05)；与模型对照组比较，氨茶碱组及复方红景参丸各剂量组TNF-α、p-p38MAPK蛋白表达降低(P<0.05，P<0.01)；各组大鼠肺组织p38MAPK蛋白表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。

4 讨论

注：黄色箭头表示肺泡相互融合增大，部分肺泡管、细支气管扩张成大型腔状结构。图1 各组大鼠肺组织形态 (HE，×200)Fig.1 Lung tissue morphologies of rats in each group (HE，×200)

慢性阻塞性肺疾病是一种常见的、可以预防和治疗的疾病，以进行性的气流受限为特征，通常是渐进性的，与气道内增强的慢性炎症以及肺部对有害颗粒或气体的反应有关[8]。COPD的发病机制复杂，以气道炎症为核心，涉及到氧化应激、线粒体功能障碍、衰老、上皮-间充质转化、铁离子代谢和基因多态性等[9-10]。COPD尽管研究广泛，但在分子水平上对其潜在机制仍知之甚少，因此目前尚无有效治疗药物，指南推荐稳定期患者吸入长效支气管扩张剂辅以中药维持治疗[11]。吸烟是导致COPD病发最主要的危险因素，因为香烟烟雾包含尼古丁、焦油、氨、CO等有毒物质，人体吸入后可引起气道炎症，呼吸道黏液大量分泌[12]。通常采用烟雾暴露联合气道滴入LPS的方法造模，该方法也是目前最为常用的COPD动物模型，能较为真实地模拟人类COPD的发病过程[13]。本研究中采用FVC、FEV1观察通气功能，通过PEF反映出气流受限程度，大鼠呼吸频率较人类快，故本研究用FEV0.1替代FEV1[14]。本实验结果发现，模型组大鼠呼吸频率加快、喘鸣、打喷嚏等症状，肺功能指标FVC、FEV0.1、PEF水平较空白对照组均降低，HE染色发现模型对照组大鼠支气管出现炎性浸润，腺体显著增生，这些结果均表明COPD大鼠模型成功建立。COPD模型大鼠在给予氨茶碱、复方红景参丸干预后，肺组织慢性炎症病理变化明显减轻，FVC、FEV0.1、PEF水平趋于正常，肺泡灌洗液白细胞总数及分类不同程度减轻，揭示复方红景参丸对COPD大鼠有较好的治疗作用。氨茶碱为茶碱与乙二胺复盐，能使支气管平滑肌松弛，且在COPD时可增强膈肌收缩力，有益于改善呼吸功能，目前是临床用于治疗COPD的常用药物[15]。复方红景参丸高剂量组与氨茶碱组疗效接近，说明复方红景参丸对慢性阻塞性肺炎具有良好的疗效，不仅能改善COPD的症状，也能改善FVC、FEV0.1、PEF等肺功能指标。

注：A为蛋白条带图，B为蛋白相对表达量统计图。与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型对照组比较，#P<0.05，##P<0.01。图2 各组大鼠肺组织TNF-α、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表达Fig.2 Expressions of TNF-α,p38MAPK and p-p38MAPK proteins in rat lung tissues in each group

近年研究发现，COPD肺内炎症细胞以肺泡巨噬细胞、中性粒细胞和CD8 T细胞为主，激活的炎症细胞释放多种炎性介质，包括LTB4、IL-8、TNF-α等，这些炎性介质能够破坏肺的结构及促进中性粒细胞炎症反应[16-19]。本研究结果显示，与空白对照组比较，模型对照组大鼠血清炎症因子LTB4、IL-6、IL-1β、TNF-α水平升高(P<0.01)；与模型对照组比较，氨茶碱与复方红景参丸降低COPD模型大鼠血清炎性因子LTB4、IL-6、IL-1β、TNF-α的水平，证实复方红景参丸治疗COPD可能与下调血清炎性因子的水平从而减轻炎症反应相关。

p38MAPK属于丝裂原活化蛋白激酶的亚类之一，属应激激活的蛋白激酶，p38MAPK是控制炎症反应最重要的成员，LPS、TNF等炎症刺激，能诱导内源性免疫细胞如单核细胞、内皮细胞和中性粒细胞内的p38激活[20]。炎症反应时血液中的白细胞从血管中游出，浸润到炎症部位，需要经过附壁、黏着、游出和趋化作用等阶段，这些都与p38 MAPK的激活紧密相关[21]。p38 MAPK的激活不仅能促进单核巨噬细胞产生TNF-α、IL6、IL-1β等炎性因子，还可介导中性粒细胞的活化[22]。中性粒细胞炎性聚集很大程度上依赖 p38 MAPK的激活，GM2CGF、TNF2α可明显增强中性粒细胞的呼吸爆发作用[23]。抑制p38MAPK通路可减少促炎因子表达，使炎症反应得以缓解，有助于改善患者肺功能。本研究Western blot结果发现各组大鼠肺组织p38MAPK表达无显著差异(P>0.05)，但慢性阻塞性肺炎模型大鼠肺组织p-p38MAPK、TNF-α表达升高，说明COPD的发生与肺组织p38MAPK通路受到激活有关。复方红景参丸干预后p-p38MAPK、TNF-α的蛋白表达较模型对照组降低，结合复方红景参丸降低COPD模型大鼠血清炎性因子LTB4、IL-6、IL-1β、TNF-α的水平，提示复方红景参丸可通过抑制p38MAPK的磷酸化激活，进一步下调炎性因子LTB4、IL-6、IL-1β、TNF-α的表达，从而修复COPD模型大鼠肺组织损伤。