万年春酒镇痛、抗炎、抗类风湿性关节炎作用

冯加华，卫克昭，张子旭，吴 欢，屈战果，章 忱，高建平*

(1.上海中医药大学中药学院，上海 201203；2.上海雷允上药业有限公司，上海 201400；3.上海中医药大学基础医学院，上海 201203)

万年春酒为上海雷允上药业有限公司研制生产的药酒，其中含有的中药包括红参、枸杞子、地枫皮、玉竹、锁阳、川牛膝、淫羊藿、丹参、红花、狗脊(制)、白术(麸炒)等，乙醇体积分数在40%～50%间。该药酒的主要功能与主治为补气健脾、益精滋肾、祛风活血、强壮筋骨，用于气虚脾弱、腰膝酸软、风湿关节痛等。其中含有的地枫皮、川牛膝、淫羊藿、狗脊等中药对治疗关节炎有一定的作用。该药酒目前在临床上作为处方药使用，使用患者有限，临床资料少且无相应的实验研究数据为其应用提供参考，限制了其临床使用，故本实验对万年春酒的抗炎、镇痛和对类风湿性关节炎的治疗作用的药效学进行实验研究，为该药酒临床用于关节炎或关节疼痛疾病提供实验依据。

1 材料

1.1 药物与给药剂量 万年春酒(上海雷允上药业有限公司，批号161101)；元胡止痛片(太极集团四川绵阳制药有限公司，批号1809005)；阿司匹林肠溶片(德国拜耳公司，批号BJ40065)；甲氨蝶呤片、醋酸地塞米松片(上海上药信谊药厂有限公司，批号036170502、015180102)。

给药剂量设计依据为万年春酒临床人用剂量(25～50 mL/次)，根据等效剂量换算倍数[1]，人与小鼠或大鼠的等效剂量按12或6倍系数计算，人体质量按60 kg计，得到小鼠等效剂量为5.0～10.0 mL/kg，大鼠等效剂量为2.5～5.0 mL/kg，以2倍等比设定3个剂量组，故小鼠药效实验低、中、高剂量分别为2.5、5.0、10.0 mL药酒/kg，大鼠药效实验低、中、高剂量分别为1.25、2.5、5.0 mL药酒/kg，给药前将药酒原液稀释到相应剂量给药。同法计算阳性药给药剂量，或参考相关文献中的剂量设定。

1.2 动物 清洁级ICR、BALB/c小鼠，雌雄各半，体质量18～22 g；清洁级SD大鼠，雌雄各半，体质量180～200 g，均购于上海斯莱克实验动物有限公司，动物生产许可证号SCXK(沪)2012-0002，饲养于上海中医药大学动物实验中心，温度22～24 ℃，相对湿度(40±5)%，每天12 h光照。

1.3 试剂 冰醋酸、二甲苯(国药集团化学试剂有限公司，批号20160108、F20090218)。不完全弗氏佐剂(美国Sigma公司，批号SLBR3 879 V)；卡介苗(上海瑞楚生物科技有限公司，批号A0318R19021)，将卡介苗(50 mg)和不完全弗氏佐剂(5 mL)混合配制成完全弗氏佐剂，质量浓度10 mg/mL；牛Ⅱ型胶原(美国Chondrex公司，批号180235)，与完全弗氏佐剂溶液按照1∶1混合用于实验。

1.4 仪器 HH-4型水浴锅(江苏杰瑞尔电器有限公司)；JA5003AL型天平(上海精天电子仪器有限公司)；0～10 mm指针式测厚仪(开拓工具国际集团，分度值0.01 mm)；Biotek Synergy HT型酶标仪(美国Bio-Tek公司)；YLS-7A型足趾体积测量仪(山东省医学科学院设备站，编号005090074)。

2 方法

2.1 镇痛作用研究

2.1.1 小鼠热水缩尾潜伏期(痛阈)将小鼠尾巴垂直浸入50 ℃水浴3 cm左右深度，检测从水浴中回缩出水面的潜伏期(基础痛阈)，10 s内视为合格，随机分成模型组、元胡止痛片组(1.5 g/kg)及万年春酒低、中、高剂量组(2.5、5.0、10.0 mL/kg)，稀释到相应剂量灌胃给药，而模型组给予等体积蒸馏水，容积均为20 mL/kg，每天1次，连续6 d。末次给药后30、60、90、120 min，检测小鼠尾巴从50 ℃水浴中回缩出水面的潜伏期，即为痛阈[1]。

2.1.2 醋酸致小鼠扭体反应 将小鼠随机分为模型组、阿司匹林组(0.2 g/kg)及万年春酒低、中、高剂量组(2.5、5.0、10.0 mL/kg)，灌胃给药，而模型组给予等体积蒸馏水，灌胃体积均为20 mL/kg，每天1次，连续3 d。末次给药后1 h，各组小鼠腹腔注射0.5%醋酸0.2 mL，观察15 min内出现扭体反应的次数，计算疼痛抑制率[1]，公式为抑制率=[(模型组扭体次数均值-药物组扭体次数均值)/模型组扭体次数均值]×100%。

2.2 抗炎作用研究 小鼠随机分为模型组、阿司匹林组(0.2 g/kg)及万年春酒低、中、高剂量组(2.5、5.0、10.0 mL/kg)，灌胃给药，模型组给予等体积蒸馏水，灌胃体积20 mL/kg，每天1次，连续5 d。末次给药后1 h，小鼠右耳内廓均匀涂抹100%二甲苯40 μL致炎，左耳不涂作为对照，1 h后脱颈椎处死，沿耳廓基线剪下双耳，用直径8 mm的打孔器分别在左右耳的同一部位冲下圆形耳片，电子天平称定质量，以两耳片质量差(右耳片质量-左耳片质量)为耳肿胀度，并计算耳肿胀抑制率[1]，公式为抑制率=[(模型组肿胀度-药物组肿胀度)/模型组肿胀度]×100%。

2.3 抗类风湿性关节炎作用研究

2.3.1 完全弗氏佐剂诱导关节炎 造模前，测量大鼠右后踝关节以下部分体积，除正常组外各组于右后足足跖中部注射0.1 mL完全弗氏佐剂以诱导关节炎[2]，1周后测量右后足踝关节以下部分(同造模前测量位置)的足体积评价模型是否成功。造模大鼠随机分为模型组、醋酸地塞米松组(2 mg/kg)及万年春酒低、中、高剂量组(1.25、2.5、5.0 mL/kg)，灌胃给药，每天1次，连续4周，而正常组、模型组大鼠灌胃等体积蒸馏水，灌胃体积10 mL/kg，每5 d称量1次大鼠体质量，根据其变化调整给药剂量，每7 d进行1次大鼠关节炎评分，测量右后足踝关节以下足体积。实验结束后，麻醉小鼠并处死，取踝关节固定、脱钙、包埋、切片后行HE染色，在光学显微镜下检测关节组织中滑膜细胞增生、细胞侵蚀、血管翳形成、炎症和骨质侵蚀评分。关节炎评分标准[2-3]为0分，无关节炎；1分，发红或微肿胀；2分，中度肿胀；3分，严重肿胀；4分，严重肿胀且不能负重或有溃烂，出现耳部红斑、尾巴风湿结节情况的，加1分。关节病理评分标准[3]为(1)滑膜细胞增殖评分，0=无增殖;1=轻微增殖，2～4层滑膜细胞；2=中度增殖，4层以上滑膜细胞；3=滑膜细胞过度增殖，侵蚀软骨和骨，关节间隙消失；(2)血管翳评分，0=无改变；1=两个部位出现血管翳；2=四个部位出现血管翳，伴有软骨表面侵蚀；3=四个以上部位出现血管翳或二个部位出现大范围血管翳；(3)炎症浸润评分，0=正常；1=轻度炎症，出现1个聚集物或少量散在炎性细胞(T细胞、B细胞、巨噬细胞、浆细胞)浸润；2=中度炎症，2个或2个以上的白细胞聚集物；3=重度炎症，炎细胞大量浸润，大量白细胞聚集，分散浸润明显；(4)骨质侵蚀评分，0=正常；1=微量侵蚀，1～2个小的浅部位；2=少量侵蚀，1～4个中等大小和深度部位；3=中等侵蚀，5个以上部位，局部侵蚀到骨皮质；4=重度侵蚀，多重损伤，局部或完全侵蚀到骨皮质；5=广泛损伤，皮质穿透骨长度的25%。

2.3.2 Ⅱ型胶原诱导关节炎 除正常组外，其他各组小鼠尾根部注射0.07 mL、足跖中部注射0.03 mL牛Ⅱ型胶原和完全弗氏佐剂的混合乳剂以诱导关节炎[4-5]，3周后再次加强免疫，根据足肿胀情况确定模型是否成功。二次免疫后，小鼠随机分为模型组、甲氨蝶呤组(1 mg/kg)及万年春酒低、中、高剂量组(2.5、5.0、10.0 mL药酒/kg)，灌胃给药，而正常组和模型组小鼠灌胃等体积蒸馏水，给药剂量20 mL/kg，每天1次，连续30 d，每7 d评估小鼠关节炎评分，测量足掌厚度。灌胃给药30 d后麻醉处死小鼠，取踝关节，固定、脱钙、包埋、切片后行HE染色，在光学显微镜下检测关节组织中滑膜细胞增生、细胞侵蚀、血管翳形成、炎症和骨质侵蚀评分。

3 结果

3.1 镇痛作用

3.1.1 对小鼠热水缩尾潜伏期(痛阈)的影响 与模型组比较，万年春酒各剂量组和元胡止痛片组给药后90、120 min，痛阈值均升高(P<0.05，P<0.01)，中剂量组给药后30 min痛阈值升高(P<0.05)，见表1。

表1 万年春酒对小鼠热水缩尾潜伏期(痛阈)的影响

3.1.2 对醋酸致小鼠扭体反应的影响 与模型组比较，万年春酒各剂量组和阿司匹林组小鼠扭体反应次数降低(P<0.01)，见表2。

表2 万年春酒对醋酸致小鼠扭体反应的影响

3.2 抗炎作用 与模型组比较，万年春酒各剂量组和阿司匹林组小鼠耳肿胀度降低(P<0.01)，见表3。

表3 万年春酒对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响

3.3 抗类风湿性关节炎作用

3.3.1 完全弗氏佐剂诱导关节炎

3.3.1.1 关节肿胀程度 与正常组比较，模型组大鼠足体积、关节炎评分升高(P<0.01)；与模型组比较，万年春酒各剂量组大鼠足体积、关节炎评分降低(P<0.05，P<0.01)，见表4～5。

表4 万年春酒对完全弗氏佐剂诱导关节炎大鼠足体积的影响

表5 万年春酒对完全弗氏佐剂诱导关节炎大鼠关节炎评分的影响(分，

3.3.1.2 踝关节病理组织学 正常组大鼠滑膜细胞覆盖在疏松结缔组织，未见滑膜细胞增生和浸润，关节软骨、骨质、关节腔间隙均正常，无炎细胞浸润；模型组大鼠滑膜细胞增生、血管翳形成、炎细胞浸润、软骨及骨质侵蚀；与模型组比较，万年春酒各剂量组和醋酸地塞米松组滑膜细胞轻度增生，少量血管翳形成、少量软骨及骨质破坏，并且中、高剂量组和醋酸地塞米松组大鼠踝关节软骨及骨质侵蚀或破坏方面改善更明显，见图1。

与正常组比较，模型组大鼠踝关节滑膜细胞增生、血管翳、炎细胞浸润、骨质侵蚀程度评分升高(P<0.01)；与模型组比较，万年春酒中剂量组大鼠踝关节炎细胞浸润、骨质侵蚀程度的病理评分降低(P<0.05)，醋酸地塞米松组和万年春酒高剂量组大鼠踝关节血管翳、骨质侵蚀程度评分降低(P<0.05，P<0.01)，见表6。

表6 万年春酒对完全弗氏佐剂诱导关节炎大鼠踝关节病理评分的影响(分，

注：A为正常组，B为模型组，C为醋酸地塞米松组，D为万年春酒低剂量组，E为万年春酒中剂量组，F为万年春酒高剂量组。图1 各组大鼠踝关节病理组织学切片(HE染色,×50)

3.3.2 Ⅱ型胶原诱导关节炎

3.3.2.1 足掌厚度、关节炎评分 治疗第6天后，与正常组比较，模型组小鼠足掌厚度、关节炎评分升高(P<0.01)；与模型组比较，万年春酒中、高剂量组小鼠足掌厚度、关节炎评分降低(P<0.01)，见表7～8。

表7 万年春酒对Ⅱ型胶原诱导关节炎小鼠足掌厚度的影响

表8 万年春酒对Ⅱ型胶原诱导关节炎小鼠关节炎评分的影响(分，

3.3.2.2 踝关节病理组织学 正常组小鼠踝关节正常，未见有炎细胞浸润，关节软骨正常，关节囊覆盖纤薄滑膜细胞；模型组小鼠踝关节充血，炎细胞轻度、大量或重度浸润，关节滑膜细胞轻度或中度增生，关节软骨中度破坏；大面积血管翳形成，关节间隙减小，骨质损伤或破坏或侵蚀；与模型组比较，各给药组小鼠踝关节炎细胞浸润、滑膜细胞的增生、血管翳形成无明显改善，而在骨质损伤、侵蚀或破坏方面，万年春酒中剂量组有一定改善作用，见图2。

与正常组比较，模型组小鼠踝关节滑膜细胞增生、血管翳、炎细胞浸润、骨质侵蚀程度评分均升高(P<0.01)；与模型组比较，万年春酒中剂量组小鼠踝关节骨质侵蚀程度评分降低(P<0.05)，见表9。

注：A为正常组，B为模型组，C为甲氨蝶呤组，D为万年春酒低剂量组，E为万年春酒中剂量组，F为万年春酒高剂量组。图2 各组小鼠踝关节病理组织学切片(HE染色,×50)

表9 万年春酒对Ⅱ型胶原诱导关节炎小鼠踝关节病理评分的影响(分，

4 讨论

万年春酒处方中，含有地枫皮、川牛膝、淫羊藿、狗脊等多种对关节炎的防治有很好效果的中药。处方中的地枫皮具有祛风除湿，行气止痛等功效，在治疗跌打损伤和风湿关节痛等方面具有良好功效[6]，在临床应用中，将其制成药酒在治疗关节炎、四肢关节酸痛等方面获得了成功案例[7]。川牛膝具有抗炎、抗超敏反应、抗痛风性关节炎等作用[8]。临床用于治疗风湿痹痛以四肢大关节肿痛疗效佳[9]。另外狗脊具有明显的镇痛和抗炎作用[10]，淫羊藿是中医治疗筋骨萎软、风湿痹痛等疾病的常用中药，现代研究中关于该药及其有效成分在镇痛、抗炎、治疗类风湿性关节炎、骨性关节炎等方面的药效研究非常多见[11]。以上中药的组成及其研究基础为该药酒用于关节痛的治疗提供了重要的依据。

关节疼痛是各种关节炎性疾病最主要的表现，是导致患者关节活动受限甚至功能丧失的主要原因，缓解疼痛是最为主要的治疗措施，可以改善患者关节的活动受限以及关节功能的退变[12]。故本研究对万年春酒的镇痛作用进行了评价。采用热刺激造模法和化学刺激法制备2种常用的检测镇痛作用效果的疼痛模型，以刺激开始至出现反应的潜伏期(痛阈)或固定时间内疼痛反应的次数作为疼痛的定量指标评价药效[1]。结果显示，万年春酒各剂量组在给药后对这物理刺激和化学刺激两种疼痛反应均有抑制作用，2.5～10.0 mL/kg万年春酒可提高小鼠对热刺激反应的阈值，抑制醋酸致小鼠扭体反应，抑制率约为47.66%～69.67%，提示镇痛效果显著，有效剂量相当于临床人用量12.5～50.0 mL/次。本研究可提示该药酒对于关节疼痛的缓解具有应用价值。

关节及其周围组织的炎症反应是各种关节炎的共性，是关节疼痛、肿胀以及功能障碍等的直接诱因，因此临床上对各种类型的关节炎抗炎治疗是主要治疗措施之一。本研究采用化学物质二甲苯刺激小鼠耳廓产生急性炎性肿胀，通过肿胀程度和肿胀抑制率评价受试药物的抗炎作用。实验结果表明，2.5～10.0 mL/kg万年春酒可抑制二甲苯致小鼠的耳肿胀，表明其具有一定的抗炎作用，有效剂量相当于临床人用量12.5～50.0 mL/次。本实验结果可提示万年春酒在消除急性炎症方面效果明显，可以为临床该药酒用于关节炎治疗提供实验依据。

类风湿性关节炎属于一种免疫性疾病，以对称性多关节炎为主要表现，关节处多有类风湿皮下结节、关节变形以及关节组织病理组织学的异常，常表现为炎细胞浸润、关节滑膜细胞增生、关节软骨破坏、关节间隙减小、骨质损伤等[13]。本实验选择了公认的两个模型[5]，弗氏佐剂诱导和Ⅱ型胶原诱导模型，通过关节肿胀百分率、关节炎评分、关节病理组织学等[1-2]评价药物作用。本研究结果显示，从灌胃给药治疗第8天开始，1.25～5.0 mL/kg万年春酒降低了关节肿胀的体积和/或关节炎评分，对关节的病理组织学的异常有改善作用；在Ⅱ型胶原诱导关节炎模型实验中，从灌胃给药治疗第6天开始，5.0～10.0 mL/kg万年春酒降低了足掌厚度和/或关节炎评分，5.0 mL/kg万年春酒对关节的病理组织学的异常有改善作用。实验结果提示万年春酒有抗类风湿性关节炎作用，可以作为该药酒用于缓解风湿关节痛的关节肿胀、变形和病理组织学异常的参考依据，有效剂量相当于临床人用量25.0～50.0 mL/次。

综上所述，本实验结果可提示万年春酒具有镇痛和抗炎作用，对类风湿性关节炎的关节炎症和关节病理组织学改变有缓解作用，为其临床治疗关节炎症性疾病提供实验依据。