葛根芩连汤对湿热型溃疡性结肠炎大鼠结肠病理损伤及Th17/Treg的影响

黄文娟，卢学嘉，房其军，朱欣佚*

(1.东南大学附属中大医院健康管理中心，江苏 南京 210000；2.东南大学附属中大医院消化科，江苏 南京 210000；3.南京鼓楼医院中医科，江苏 南京 210000)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是临床常见的慢性非特异性胃肠道疾病，以腹痛、血便等为主要临床表现，迁延难愈，且可能发展为结肠癌。近年来研究发现，辅助性T细胞17(T helper cell 17，Th17)和调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)调控关系的失衡是溃疡性结肠炎发病的主要因素[1]。Th17、Treg细胞在分化中相互抑制且在功能上负性调节，两者动态平衡在维持免疫稳定中发挥关键作用[2-3]。因此，调节Th17/Treg平衡，恢复机体免疫稳态，可能是治疗溃疡性结肠炎的新途径。

葛根芩连汤，始载于《伤寒论 太阳病脉证并治》，以清热、坚阴、止痢为主，兼有透表、解表清里之功，已在溃疡性结肠炎治疗中获取满意效果[4-5]。但关于其对湿热型溃疡性结肠炎结肠病理损伤及Th17/Treg影响的研究尚少。本研究采用湿热型溃疡性结肠炎大鼠模型，研究葛根芩连汤对其结肠病理损伤及Th17/Treg的影响，为治疗该病提供实验依据。

1 材料

1.1 动物 SPF级SD大鼠70只，雌雄各半，6周龄，体质量180～200 g，购自上海南方模式生物科技股份有限公司，实验动物生产许可证号SCXK(沪)2017-0010，适应性喂养3 d。

1.2 试剂与药物 葛根芩连汤由东南大学附属中大医院提供，按照葛根、黄连、黄芩、甘草=8∶3∶3∶2比例浸泡30 min，加入8倍量水煎煮40 min，3 500 r/min离心20 min，浓缩成生药量20 g/10 mL的浓缩液，使用前用生理盐水稀释至相应质量浓度，4 ℃冷藏保存。柳氮磺胺吡啶片(生产批号02000052，国药准字H31020557，上海信谊嘉华药业有限公司)。2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)溶液(南京信帆生物技术有限公司)；CD4抗体、白介素-17(IL-17)抗体、Foxp3抗体(上海古朵生物科技有限公司)；兔抗大鼠维甲酸相关孤儿受体γt(retinoid-related orphan receptor gamma-t，RORγt)、叉状头/翅膀状螺旋转录因子(forkhead/winged helix transcription factor，Foxp3)一抗(英国Abcam公司)。

1.3 仪器 FACSCanto Ⅱ流式细胞仪(美国BD公司)；H7500电子显微镜(日本株式会社日立制作所)；iBright Imager凝胶成像分析系统(美国Thermo Fisher Scientific公司)。

2 方法

2.1 模型建立 采用高糖、高脂饮食饲养大鼠，即在普通饲养的基础上增加蜂蜜水200 g/L自由饮用，隔天灌胃给予10 g/kg油脂，隔天灌胃给予10 mL/kg白酒，共10 d，饲养于相对湿度95%、温度(32±2)℃的气候箱中，共计5 d。将大鼠从气候箱中移出，禁食不禁水24 h，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，固定于手术台上，从肛门轻插入一根橡胶输液管(长12 cm，直径2.0 mm)深约8 cm，100 mg/kg TNBS溶于500 mL乙醇中，一次性推入结肠0.25 mL，提大鼠尾部使其倒立30 s，保持平躺，观察一般情况。模型建立10 d后，根据大鼠一般情况判断建模是否成功[6]。

2.2 分组及给药 从70只大鼠中随机抽取10只饲喂普通饲料，其余60只建立湿热型溃疡性结肠炎模型，将建模成功的50只随机分为模型组，葛根芩连汤低、中、高剂量组，柳氮磺胺吡啶组，每组10只。建模后10 d，葛根芩连汤低、中、高剂量组开始以5、10、20 g/kg生药量灌胃给予浓缩液；柳氮磺胺吡啶组将药物捣碎、研磨后，与生理盐水混合，以0.3 g/kg剂量灌胃给药。各组给药容积均为10 mL/kg，连续干预2周；正常组、模型组灌胃给予等容量生理盐水灌胃。观察大鼠一般情况，采用疾病活动指数(disease activity index，DAI)评分评价，包括①体质量分为不变(0分)、较正常降低1～5%(1分)、6～10%(2分)、11～15%(3分)、>15%(4分)；②大便泄泻程度分为正常(0分)、松散(2分)、腹泻(4分)；③便血分为正常(0分)、肉眼血便(2分)。

2.3 外周血单个核细胞(PBMC)分离 末次给药后，大鼠禁食24 h不禁水，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，采集腹主动脉血5 mL，置于肝素抗凝管中，与PBS缓冲液等比例稀释，梯度离心后分离淋巴细胞，PBS缓冲液洗涤，调整细胞密度至1×107/mL。

2.4 外周血Th17细胞比例检测 取96孔板，每孔中加入PBMC悬液100 μL，设置同型对照，加入刺激剂0.5 μL(调零孔除外)，置于培养箱中培养60 min，以0.5 μL阻断剂阻断，在标准条件(5% CO2、37 ℃、饱和湿度)下孵育12 h，将细胞悬液转移至流式管中，加入0.5 μL CD4抗体，常温下遮光孵育20 min，PBS缓冲液洗涤，离心后弃去上清，加入100 μL PBS重悬，再加入固定破膜工作液，振荡5 s混合均匀，4 ℃遮光孵育40 min，加入破膜缓冲工作液2 mL，离心后洗涤细胞，弃去上清，余下液体中加入PBS缓冲液至100 μL，重悬，在检测管中加入IL-17抗体0.7 μL，将等量、同型对照抗体加入对照管中，4 ℃遮光孵育40 min，洗涤后弃上清，加入4%多聚甲醛重悬，4 ℃遮光保存，24 h内使用流式细胞仪检测。

2.5 外周血Treg细胞比例检测 取PBMC悬液100 μL转移至流式管中，加入CD4抗体0.5 μL，常温遮光孵育20 min，PBS洗涤后弃去上清，余下液体中加入PBS缓冲液至100 μL，重悬，在检测管中加入Foxp3抗体5 μL，将等量、同型对照抗体加入对照管中，4 ℃遮光孵育40 min，洗涤后弃上清，加入4%多聚甲醛重悬，4 ℃遮光保存，24 h内使用流式细胞仪检测。

2.6 结肠组织病理变化观察 腹主动脉血取血后处死大鼠，打开腹腔，分离结肠病变区组织，分为2份，1份用4%多聚甲醛固定后梯度脱水，二甲苯透明后石蜡包埋，制作成5 μm切片；另1份保存于液氮中，用于蛋白检测。取大鼠结肠组织切片常规脱蜡，冲洗1 min，加入苏木素染色液染色5 min后冲洗2 min，滴入1%盐酸酒精，冲洗2 s，促蓝液反蓝，冲洗15 s，1%伊红液染色30 s，自来水略洗后依次使用85%乙醇、95%乙醇、无水乙醇脱水，每次30 s，二甲苯透明2次，每次3 s，中性树胶封固，显微镜下拍照观察。

2.7 结肠组织IFN-γ表达检测 取大鼠结肠组织切片，脱蜡后PBS冲洗，3%过氧化氢孵育15 min，PBS浸泡30 min，滴加枸橼酸盐抗原修复液，微波后冷却至40 ℃，蒸馏水冲洗，滴加山羊血清室温下封闭15 min，弃血清，滴加兔抗大鼠IFN-γ一抗(1∶800)，湿盒中4 ℃过夜，PBS冲洗，滴加山羊抗兔IgG二抗(1∶2 000)，37 ℃孵育15 min，PBS冲洗，DAB显色，自来水冲洗，苏木素复染，常规脱水，中性树胶封片，在显微镜下观察，随机选取5个不相邻视野，计算IOD值。

2.8 结肠组织RORγt、Foxp3蛋白表达检测 采用Western blot法。取冷冻保存的大鼠结肠组织，充分研磨后加入裂解液提取总蛋白，BCA法定量蛋白浓度，取30 μg上样，10% SDS-PAGE电泳后湿转至膜，室温下封闭液封闭2 h，加入兔抗大鼠RORγt、Foxp3一抗(1∶500)，4 ℃摇床孵育过夜，洗涤，滴加山羊抗兔二抗(1∶2 000)，室温孵育1 h，暗室中曝光、显影、定影，凝胶成像系统扫描，计算目的蛋白/内参GAPDH条带灰度值比值。

3 结果

3.1 大鼠一般情况 高糖、高脂饲养，灌服白酒加TNBS推入结肠后，可导致大鼠食欲不振、体质量减轻、喜卧懒动、精神萎靡，便稀或黏液样血便、便次增加，类似脾胃湿热的表现，表明建模成功。与模型组比较，柳氮磺胺吡啶组、葛根芩连汤各剂量组大鼠上述表现明显改善。与正常组比较，模型组大鼠DAI评分升高(P<0.01)；与模型组比较，柳氮磺胺吡啶组、葛根芩连汤各剂量组大鼠DAI评分均降低(P<0.05，P<0.01)，并呈量效关系，见表1。

表1 葛根芩连汤对大鼠DAI评分的影响

3.2 结肠病理变化 正常组大鼠结肠黏膜光滑、完整，腺体层次清晰，未观察到中性粒细胞浸润、溃疡、糜烂等；模型组大鼠结肠组织明显水肿、充血，肠壁凹陷，黏膜上皮细胞损伤破裂、排列紊乱，细胞核模糊、缩聚，可观察到细胞脱落及肠绒毛损伤、大量炎性细胞浸润；柳氮磺胺吡啶组、葛根芩连汤各剂量组大鼠上述病理变化有所减轻，见图1。

图1 各组大鼠结肠组织病理变化(HE，×100)

3.3 葛根芩连汤对大鼠结肠组织IFN-γ表达的影响 与正常组比较，模型组大鼠IFN-γ表达升高(P<0.01)；与模型组比较，柳氮磺胺吡啶组、葛根芩连汤各剂量组大鼠IFN-γ表达降低(P<0.05，P<0.01)，并呈量效关系，见表2、图2。

图2 各组大鼠结肠组织IFN-γ表达(HE，×400)

表2 葛根芩连汤对大鼠结肠组织IFN-γ表达的影响

3.4 葛根芩连汤对大鼠外周血Th17/Treg平衡的影响 与正常组比较，模型组大鼠外周血Th17、Th17/Treg升高(P<0.01)，Treg比例降低(P<0.01)；与模型组比较，柳氮磺胺吡啶组、葛根芩连汤各剂量组大鼠外周血Th17、Th17/Treg降低(P<0.05，P<0.01)，Treg比例升高(P<0.01)，并呈量效关系，见表3。

表3 葛根芩连汤对大鼠外周血Th17/Treg平衡的影响

3.5 葛根芩连汤对大鼠结肠组织RORγt、Foxp3蛋白表达的影响 与正常组比较，模型组大鼠结肠组织RORγt蛋白表达升高(P<0.01)，Foxp3蛋白表达降低(P<0.01)；与模型组比较，柳氮磺胺吡啶组、葛根芩连汤各剂量组大鼠结肠组织RORγt蛋白表达降低(P<0.05，P<0.01)，Foxp3蛋白表达升高(P<0.01)，并呈量效关系，见表4、图3。

表4 葛根芩连汤对大鼠结肠组织RORγt、Foxp3蛋白表达的影响

图3 各组大鼠结肠组织RORγt、Foxp3蛋白表达

4 讨论

溃疡性结肠炎是在遗传易感性、环境因素、肠道微生物等作用下，肠道免疫功能异常导致的一种发病于直肠与结肠的炎性病变[7]。中医认为，溃疡性结肠炎属于“脏毒”“肠澼”“便血”等范畴，以本虚标实、虚实夹杂为病机，可生成痰、瘀、湿、热、毒，导致病程迁延难愈[8]。湿热型溃疡性结肠炎病位在大肠，因邪盛正虚、饮食不洁、情志不调而发病，多为湿热蕴滞大肠，致脾肾亏虚，故以清热燥湿、养血生肌、补脾益肠、凉血止痢为治疗原则[9-10]。

Th17细胞主要通过释放炎性因子IL-17加剧炎性反应，而Treg细胞可抑制抗原呈递细胞及T细胞功能，减少炎性细胞因子及抗体产生，对于维持自身免疫耐受及免疫内环境平衡起到关键性作用[11]。IFN-γ是一种由活化的中性粒细胞与T细胞分泌的细胞因子，其可通过调节免疫细胞平衡参与细胞免疫，并通过招募炎性细胞导致肠成纤维细胞生成大量基质降解酶，破坏黏膜完整性，引发溃疡。本研究结果显示，葛根芩连汤各剂量组可改善大肠结肠病理变化，且可降低外周血中Th17细胞比例，提高Treg比例，维持Th17/Treg平衡，减少结肠组织中IFN-γ表达，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，表明葛根芩连汤可调节Th17/Treg平衡，减轻结肠病理变化与黏膜损伤。葛根芩连汤是经典古方之一，由医圣张仲景创立，方中以葛根为主药，味辛、凉、甘，透表解肌，升脾胃清阳之气，治下痢；黄芩性苦寒，可清肺胃胆、上焦、大肠湿热；黄连性大苦、大寒，泻火解毒、清中焦湿热；甘草安正和中，调和诸药。诸药配伍，共奏燥湿清热、解表清里、凉血止痢、祛腐生新的功效，调和脾胃，虚实兼治。现代药理学研究表明，葛根素、黄芩苷及黄连素均可有效升高外周血中抗炎因子水平，同时减少促炎因子生成，具有显著抗炎作用[12-14]。张宁等[15]在常规治疗的基础上，联合使用加味葛根芩连汤治疗重度湿热型溃疡性结肠炎患者，效果满意。

研究发现，RORγt、Foxp3分别是调控Th17、Treg细胞分化的重要转录因子，且具有特异性[16]。RORγt表达异常降低时，Th17与其释放的IL-17表达将明显降低，而当其表达升高时，CD4+T细胞无需被外来细胞因子诱导即能表达IL-17。Foxp3特异性表达于CD4+CD25+Tregs中，通过分泌TGF-γ、IL-10等抑制性细胞因子、细胞间接触抑制等途径维持自身免疫耐受，发挥抗炎作用。本研究结果显示，葛根芩连汤各剂量组可降低结肠组织中RORγt蛋白表达，上调Foxp3表达，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，表明葛根芩连汤可能通过影响RORγt、Foxp3表达，从而调节Th17/Treg平衡，减轻结肠组织病理变化，并表现为一定的剂量关系。