丹酚酸A对干扰素γ和TRAIL联合诱导的HaCaT细胞的影响及其机制

王 静，邓庆华

(1.江苏医药职业学院药学院，江苏 盐城 224005；2.重庆医药高等专科学校药学院，重庆 401331)

特应性皮炎是一种多功能、异质性的慢性炎症性皮肤病，因其遗传和化学过敏原等多种环境因素的复杂相互作用，其临床表现各异[1]。常用的治疗特应性皮炎的药物是抗炎皮质类固醇。然而，这些类固醇的长期使用可引起皮肤萎缩和全身不良影响[2]。因此，需要开发副作用低的新天然候选物来治疗和缓解该病。丹酚酸A是从中药丹参中提取的一种具有生物活性的多酚化合物[3]。研究表明，丹酚酸A是一种具有多种药理活性的多靶点药物，如抗氧化、抗炎症、抗纤维化、抗血小板剂和抗血栓[4-6]。丹酚酸A抑制过氧化氢诱导的人脐静脉内皮细胞损伤[7]，其对缺血再灌注急性期脑具有保护作用[8]。核转录因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信号通路在多种炎症性皮肤病的发病机理中起关键作用[9]。然而丹酚酸A在干扰素γ(IFN-γ)和TRAIL联合诱导的人皮肤HaCaT细胞损伤中的功能，及其是否通过NF-κB信号通路发挥作用目前仍不清楚。基于此，本研究构建IFN-γ和TRAIL联合诱导的人皮肤HaCaT细胞损伤模型[10-11]，考察了丹酚酸A对细胞增殖、凋亡和炎症因子分泌的影响，并评估了丹酚酸A在HaCaT细胞损伤过程的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、药物与试剂 人皮肤HaCaT细胞购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。丹酚酸A(纯度≥98%)购自成都曼斯特生物公司。高糖DMEM培养基购自美国Gibco公司；IFN-γ、TRAIL购自美国PeproTech公司；佛波酯购自美国Sigma公司；白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白细胞介素-1β(inter leukin-1β，IL-1β)酶联免疫(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒购自美国eBioscience公司；异硫氰酸荧光素标记的膜联素Ⅴ/碘化丙啶(Annexin Ⅴ-FITC/PI)细胞凋亡检测试剂盒、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，cleaved caspase-3)、IκBα、磷酸化IκBα(p-IκBα)、NF-κB p65和磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)一抗购自英国Abcam公司；辣根过氧化物酶标记二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 细胞培养 HaCaT细胞于含10%胎牛血清、1%青-链霉素高糖DMEM培养基中培养后，在37 ℃、5% CO2、湿润环境中继续培养。

1.3 MTT检测HaCaT细胞活性 收集对数生长期的HaCaT细胞接种于96孔板，接种密度为1×104/孔，37 ℃孵育24 h，分别加入2.5、5、10、20、40、80、160 μmol/L丹酚酸A[8]，同时将不含丹酚酸A的细胞作为正常培养组，继续培养24、48、72 h。处理结束后，加入5 mg/mL MTT溶液10 μL反应4 h，然后加入150 μL二甲基亚砜，摇床振荡10 min溶解结晶，酶标仪检测波长490 nm处光密度(OD)值。细胞存活率=(实验组OD值/对照组OD值)×100%。

1.4 细胞处理与分组 MTT筛选出最佳丹酚酸A给药浓度(10 μmol/L)后，将细胞HaCaT随机分为正常培养组(正常培养的细胞HaCaT)、IFN-γ+TRAIL组(50 μg/L IFN-γ和4 μg/L TRAIL联合处理HaCaT细胞48 h[12])、IFN-γ+TRAIL+丹酚酸A 10 μmol/L组(IFN-γ、TRAIL、10 μmol/L丹酚酸A处理细胞HaCaT)、IFN-γ+TRAIL+丹酚酸A+佛波酯组(IFN-γ、TRAIL、10 μmol/L丹酚酸A、0.5 μmol/L 佛波酯处理细胞HaCaT)、IFN-γ+TRAIL+丹酚酸A+PBS组(IFN-γ、TRAIL、10 μmol/L丹酚酸A、PBS处理细胞HaCaT)，给药时先加入10 μmol/L丹酚酸A处理2 h，再进行IFN-γ、TRAIL联合处理。处理结束后收集细胞，按“1.3”项下方法检测HaCaT细胞的活性。

1.5 流式细胞术检测HaCaT细胞凋亡 按“1.4”项下方法收集HaCaT细胞，调整密度为1×106/mL，重悬于缓冲液，依次加入Annexin V-FITC、PI各5 μL充分混合，混匀后于室温避光反应，15 min后采用流式细胞仪检测HaCaT细胞凋亡。

1.6 ELISA法检测IL-6、IL-1β水平 按“1.4”项下方法收集HaCaT细胞，严格按照相关 ELISA试剂盒的步骤检测IL-6、IL-1β水平。

1.7 Western blot检测cleaved caspase-3、IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达 按“1.4”项下方法处理细胞后，采用RIPA裂解液提取蛋白，通过BCA试剂盒定量后取30 μg蛋白样品进行12% SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，加入cleaved caspase-3、IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65、β肌动蛋白(β-actin)一抗(1∶1 000)，在4 ℃下过夜孵育，洗膜后加入辣根过氧化物酶标记二抗(1∶5 000)孵育2 h，使用ECL增强发光液显色，曝光，以β-actin为内参蛋白，采用Image J软件分析各蛋白条带。

2 结果

2.1 丹酚酸A对HaCaT细胞存活率的影响 如表1所示，与正常培养组比较，不同浓度丹酚酸A分别作用于人皮肤HaCaT细胞24、48、72 h，细胞存活率呈先下降后升高再下降的趋势，以10 μmol/L丹酚酸A效果最显著，故后续选择该浓度进行实验。

表1 丹酚酸A对HaCaT细胞存活率的影响

2.2 丹酚酸A对IFN-γ、TRAIL联合处理HaCaT细胞存活率的影响 如表2所示，与正常培养组比较，IFN-γ+TRAIL组24、48、72 h细胞存活率降低(P<0.05)；与IFN-γ+TRAIL组比较，IFN-γ+TRAIL+丹酚酸A 10 μmol/L组24、48、72 h细胞存活率升高(P<0.05)。

表2 丹酚酸A对HaCaT细胞存活率的影响

2.3 丹酚酸A对HaCaT细胞凋亡和炎症因子分泌的影响 如图1、表3所示，与正常培养组比较，IFN-γ+TRAIL组细胞凋亡率、cleaved caspase-3蛋白表达、IL-6和IL-1β水平均升高(P<0.05)；与IFN-γ+TRAIL组比较，IFN-γ+TRAIL+丹酚酸A 10 μmol/L组HaCaT细胞凋亡率、cleaved caspase-3蛋白表达、IL-6和IL-1β水平降低(P<0.05)。

表3 丹酚酸A对HaCaT细胞凋亡和炎症因子分泌的影响

图1 各组HaCaT细胞凋亡(A)、cleaved caspase-3蛋白表达(B)

2.4 丹酚酸A对HaCaT细胞NF-κB信号通路的影响 如图2、表4所示，与正常培养组比较，IFN-γ+TRAIL组p-IκBα、p-NF-κB p65蛋白表达升高(P<0.05)，IκBα、NF-κB p65蛋白表达无明显变化(P>0.05)；与IFN-γ+TRAIL组比较，IFN-γ+TRAIL+丹酚酸A 10 μmol/L组p-IκBα、p-NF-κB p65蛋白表达降低(P<0.05)，IκBα、NF-κB p65蛋白表达无明显变化(P>0.05)。

表4 丹酚酸A对HaCaT细胞NF-κB信号通路的影响

图2 各组HaCaT细胞IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达

2.5 佛波酯抑制丹酚酸A对HaCaT细胞的保护作用 如图3、表5所示，与IFN-γ+TRAIL+丹酚酸A+PBS组比较，IFN-γ+TRAIL+丹酚酸A+佛波酯组24、48、72 h细胞存活率降低(P<0.05)，IκBα、NF-κB p65蛋白表达无明显变化(P>0.0.5)，p-IκBα蛋白表达增加(P<0.05)。

表5 佛波酯抑制丹酚酸A对HaCaT细胞存活率的保护作用

图3 各组细胞IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达

2.6 佛波酯促进丹酚酸A对HaCaT细胞凋亡和抑制炎症因子分泌 图4、表6显示，与IFN-γ+TRAIL+丹酚酸A+PBS组比较，IFN-γ+TRAIL+丹酚酸A+佛波酯组细胞凋亡率、cleaved caspase-3蛋白表达及IL-6、IL-1β水平升高(P<0.05)。

表6 佛波酯促进丹酚酸A对HaCaT细胞凋亡和抑制炎症因子分泌

图4 各组细胞凋亡(A)、cleaved caspase-3蛋白表达(B)

3 讨论

表皮的主要功能是提供屏障，保护人体免受环境因素的影响。角质形成细胞是角蛋白产生的表皮细胞，约占表皮细胞的90%[13]。角质形成细胞除了维持皮肤的生化和物理状态，也参与各种炎症性皮肤病的发展，其释放炎症介质，例如促炎细胞因子和趋化因子，以响应包括紫外线，过敏原和化学制剂在内的免疫触发[14]。在本研究中，以体外培养的人皮肤HaCaT细胞为对象，采用IFN-γ和TRAIL联合诱导损伤HaCaT细胞，发现丹酚酸A对细胞损伤具有一定的保护作用，并且这种保护作用与调控NF-κB途径有关，为特应性皮炎的药物开发提供了新的启示。

细胞凋亡是角质形成细胞在正常和病理状态下的另一个重要生理因素[15]。细胞凋亡是细胞死亡的一种程序化形式，它是一种严格调控的生化过程，通过多种与蛋白酶(如降解蛋白质的caspases)激活相关的不同机制发生。caspase-3被认为是最重要的执行因子，可被任何一种启动子caspase(caspase-8、-9或-10)激活[16]。炎症因子IL-1β和IL-6等过度表达与特应性皮炎相关，并参与病理反应的诱导，被认为是皮肤炎症发病的关键因素[17]。本实验中，丹酚酸A提高IFN-γ和TRAIL联合诱导的HaCaT细胞存活率，降低细胞的凋亡率和cleaved caspase-3蛋白表达，提示丹酚酸A通过可以促进IFN-γ和TRAIL联合损伤的HaCaT细胞增殖，并减少细胞凋亡。同时，丹酚酸A降低了IFN-γ和TRAIL联合诱导的人皮肤HaCaT细胞中炎症因子IL-6和IL-1β的分泌，说明丹酚酸A可以减轻人皮肤HaCaT细胞损伤后的炎症反应。由此可见，在IFN-γ和TRAIL联合损伤的HaCaT细胞中，丹酚酸A一方面促进细胞的增殖能力和抑制凋亡，另一方面抑制细胞中炎症因子的分泌，从而发挥保护作用，与丹酚酸A在其他模型损伤中[7-8]的功能相符。

NF-κB家族包括被各种刺激激活的关键转录因子，如TNF-α、IFN-γ和脂多糖等[18]。刺激后，细胞质中的NF-κB复合物易位至细胞核，并参与众多促炎基因的表达[19]。NF-κB信号通路已被证明与HaCaT细胞炎症有关[20]，IFN-γ和TNF-α可以激活角质形成细胞中的NF-κB途径[21]。本研究中，IFN-γ和TRAIL联合诱导使HaCaT细胞内p-IκBα、p-NF-κB p65蛋白表达升高，使用丹酚酸A处理则抑制了此作用，提示丹酚酸A对IFN-γ和TRAIL联合诱导的HaCaT细胞损伤的保护作用可能是通过抑制NF-κB信号通路活性而实现的。另外，NF-κB信号通路激活剂佛波酯能够抑制丹酚酸A对IFN-γ和TRAIL联合损伤的HaCaT细胞存活率的促进作用，并能促进丹酚酸A对细胞凋亡、炎症因子分泌的抑制作用。这些结果证实，抑制NF-κB信号通路是丹酚酸A在IFN-γ和TRAIL联合损伤的HaCaT细胞中发挥药效的重要途径。

总之，丹酚酸A对IFN-γ和TRAIL联合诱导的HaCaT细胞损伤具有一定的保护效果，可以促进细胞的增殖，并抑制凋亡和细胞炎症因子的分泌，这种保护作用可能与调控NF-κB信号通路有关。