补肾疏肝方对老年抑郁症大鼠血清炎症因子和海马神经递质的影响

揭会贤，李 显，杨振博，姚建平*，封银曼

(1.河南中医药大学基础医学院，河南 郑州 450046；2.郑州卫生健康职业学院，河南 荥阳 450100)

中医认为，肾虚是导致衰老的重要原因之一，肝气郁结是抑郁症发病重要机理。因此，本实验研究结合“肾虚致衰”“肝郁致郁”的中医理论和现代医学关于单胺类神经递质及炎症因子在抑郁症发病中的作用，以自然衰老结合慢性不可预见性应激的方法复制自然衰老抑郁症大鼠模型，从行为学、海马单胺类神经递质及血清炎症细胞因子等方面观察补肾疏肝方的作用，进一步探索该方治疗老年抑郁症的作用机理，并为其临床应用提供理论依据。

1 材料

1.1 药物与试剂 补肾疏肝方组成为熟地24 g、山茱萸12 g、鹿角胶12 g、枸杞子12 g、川牛膝9 g、山药12 g、菟丝子12 g、龟板胶12 g、柴胡6 g、陈皮6 g、川芎4.5 g、白芍4.5 g、炙甘草1.5 g香附4.5 g、枳壳4.5 g，中药(饮片)一次性购于河南省东升药材公司；盐酸氟西汀(常州四药制药有限公司，批号H19980139)。大鼠IL-1 ELISA试剂盒(批号E20171112A)，大鼠IL-4 ELISA试剂盒(批号E2017105A)，大鼠IL-6 ELISA试剂盒(批号E20171109A)，大鼠IL-8 ELISA试剂盒(批号E20171030A)，大鼠IL-10 ELISA试剂盒(批号E20171102A)，大鼠TNF-α ELISA试剂盒(批号E20171102A)，均购于苏州卡尔文生物科技有限公司；5-HT对照品(美国Sigma公司，批号BCBS5678V)，DA对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号S05J6G2)，NE对照品(上海阿拉丁生化科技有限公司，批号E1725027)。

1.2 动物 雄性SD大鼠52只，清洁级，山东省实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK(鲁)2014-0007。

1.3 仪器 酶标仪(美国Thermo 公司)；敞箱装置(自制)；恒温箱(上海精宏实验设备有限公司)；低温离心机(美国Thermo 公司)；高效液相系统(美国Thermo 公司)；电化学检测器(美国Thermo 公司)；C18色谱柱(美国Agilent公司)。

2 方法

2.1 动物分组及喂养 52只SD雄性大鼠随机分为空白对照组、老年抑郁症模型组、补肾疏肝方组及盐酸氟西汀组，共4组，每组13只。普通饮食、饮水，温度18～25 ℃，相对湿度60%～70%，自然昼夜节律光照。

2.2 补肾疏肝方药液制备 中药饮片用蒸馏水常规煎煮，终质量浓度为含生药量1 g/mL药液，分装，于冰箱4 ℃保存。

2.3 造模及干预 大鼠常规喂养至16月龄。自16月龄始，除空白对照组外，其余3组均采用轻度慢性不可预见性应激(CUMS)的方法进行造模，采取禁水(24 h)、禁食(24 h)、夹尾(1 min/次)、合并鼠笼、倾斜鼠笼45°、潮湿垫料、昼夜颠倒等7种应激方法，每天随机选取一种应激方法，每种方法使用不超过3次；造模同时，补肾疏肝方组大鼠灌胃补肾疏肝方药液14.6 g/kg，盐酸氟西汀组大鼠灌胃盐酸氟西汀药液1.8 mg/kg，空白对照组和老年抑郁症模型组大鼠灌胃等容量生理盐水。共计21 d。

2.4 组织取材 大鼠腹腔注射8%水合氯醛进行麻醉，腹主动脉取血，室温静置10 min，3 000 r/min离心15 min，分离血清，置-80 ℃保存备用；分离海马组织，-80 ℃保存待用。

郭书凤寻思寻思也是这么回事，但是不能因为怕，就不干了吧！一天，在石坡乡组织的一次林果技术帮扶会上，藏在郭书凤和李贵夫妇心里的疑团解冻了。

2.5 指标检测

2.5.1 大鼠旷场试验(open-field test,OFT)行为学评定

敞箱装置由不透明木质材料制成，底面100 cm×100 cm，高约60 cm，底面由不脱色笔等分为25个正方形，8:00～12:00在安静独立房间进行测试。将大鼠放入正中央方格中，记录5 min穿越格数(4只脚同时跨越计算为1格)与直立次数(两前肢离地或攀附墙壁算为1次)，每穿越1格得1分，直立1次得1分，两项相加为OFT总得分。

2.5.2 ELISA法检测 采用酶联免疫吸附法检测 大鼠血清IL-1、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α水平，操作均按试剂盒说明书完成。

2.5.3 高效液相电化学法检测大鼠海马组织DA、NE和5-HT水平 样品处理，取海马组织100 mg，加入冰冷的0.1 mol/L高氯酸溶液1 mL，冰浴匀浆5 min；15 000 r/min离心15 min(4 ℃)，取上清待测。色谱条件，C18色谱柱，柱温35 ℃；流动相的体积流量0.8 mL/min；ECD(电化学)检测器采用玻碳电极，电压350 mv，电流10 mA；进样量15 μL。

3 结果

3.1 补肾疏肝方对大鼠行为学的影响

3.1.1 补肾疏肝方对大鼠OFT水平得分的影响 结果表明(表1)，造模前，各组大鼠水平得分无显著差异(P>0.05)。造模后，与空白对照组比较，老年抑郁症模型组大鼠水平得分降低 (P<0.01)；与老年抑郁症模型组比较，补肾疏肝方组和盐酸氟西汀组大鼠水平得分均升高(P<0.01)。

表1 造模前后各组大鼠OFT水平得分

3.1.2 补肾疏肝方对大鼠OFT垂直得分的影响 结果表明(表2)，造模前，各组大鼠水平得分无显著差异(P>0.05)。造模后，与空白对照组比较，老年抑郁症模型组大鼠垂直得分降低 (P<0.01)；与老年抑郁症模型组比较，补肾疏肝方组和盐酸氟西汀组大鼠垂直得分升高(P<0.01)。

表2 造模前后各组大鼠OFT垂直得分

3.2 补肾疏肝方对大鼠血清炎症细胞因子的影响

3.2.1 补肾疏肝方对大鼠血清促炎性细胞因子IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α水平的影响 结果表明(表3)，与空白对照组比较，老年抑郁症模型组大鼠血清L-1、IL-6、IL-8和TNF-α水平均升高 (P<0.01)；与老年抑郁症模型组比较，补肾疏肝方组和盐酸氟西汀组大鼠血清IL-6、IL-8和TNF-α水平均降低(P<0.01)，补肾疏肝方组大鼠血清IL-1水平降低(P<0.01)，盐酸氟西汀组大鼠血清IL-1水平降低(P<0.05)。

表3 各组大鼠血清IL-1、IL-6、IL-8 和TNF-α的水平

3.2.2 补肾疏肝方对大鼠血清抗炎症细胞因子IL-4、IL-10水平的影响 结果表明(表4)，与空白对照组比较，老年抑郁症模型组大鼠血清IL-4、IL-10水平均降低(P<0.01)；与老年抑郁症模型组比较，补肾疏肝方组和盐酸氟西汀组大鼠血清IL-4、IL-10水平均升高(P<0.01)。

表4 各组大鼠血清IL-4和IL-10的水平

3.3 补肾疏肝方对大鼠海马组织的影响 结果表明(表5)，与空白对照组比较，老年抑郁症模型组大鼠海马组织NE、DA和5-HT的水平下降 (P<0.01)；与老年抑郁症模型组比较，补肾疏肝方组和盐酸氟西汀组大鼠海马组织NE、DA和5-HT的水平上升 (P<0.01)。

表5 各组大鼠海马NE、DA和5-HT的水平

4 讨论

肾虚肝郁是老年抑郁症的基本病机，肾虚是致郁之本，肝郁是郁证之标。左归丸与柴胡疏肝散皆源于《景岳全书》，两者合方组成补肾疏肝方既可补肾精之亏，又可疏肝气之郁。中医的脑髓可与现代医学的脑内神经元相联系，其细胞萎缩和凋亡造成髓海不足[8]。基于中医整体观念与现代生物学基础紧密结合提出的“肾脑系统”为临床治疗相关疾病提供新思路[9-10]。研究表明，从肾论治并配伍疏肝等疗法能大大提高老年抑郁症的疗效[11]。如用补肾活血汤配合中医情志疗法有助于改善患者的抑郁症状以提高临床疗效[12]。王越等[13]运用补肾通阳法治疗老年抑郁症获得与西药同样疗效。因此，采用补肾疏肝方治疗老年抑郁症有着坚实的理论基础和丰富的实践经验。

现代医学有关抑郁症的学说较多，如“抑郁症的细胞因子”假说[14]。该假说认为抑郁症与被过度激活的免疫系统紧密联系，当免疫炎症反应被过度激活时，将通过促炎性细胞因子介导致使神经递质紊乱以及传导环路失调，从而影响大脑功能，导致神经内分泌发生变化，进而产生抑郁相关行为[15-17]。有研究表明，炎症与抑郁症二者关系密切且存在内在相互促进与影响[18]，炎症细胞因子与抑郁症状关系密切[19]。炎症细胞因子包括促炎性细胞因子与抗炎性细胞因子，促炎性细胞因子包括IL-1、IL-6、IL-8及TNF-α等，促炎性细胞因子是激活免疫以及产生炎症反应的关键细胞因子，通过在局部或远端刺激免疫细胞发动细胞攻击，致使抑郁症的发生[20]；抗炎性细胞因子包括IL-4、IL-10等，其作用主要是抑制或停止炎症反应，保护细胞受到伤害，使抑郁症患者从病态中康复[21]。各种应激反应均会激活免疫系统[22]。本研究是通过21天 CUMS刺激制备老年抑郁大鼠模型，经过21 d刺激后，各造模组大鼠OFT水平和垂直得分均降低，同时模型组血清中促炎性细胞因子升高，抗炎性细胞因子降低，也进一步说明了慢性应激激活了老年抑郁大鼠的免疫炎症反应。而补肾疏肝方可降低老年抑郁症模型大鼠血清促炎性细胞因子IL-1、IL-6、IL-8及TNF-α等的水平，升高抗炎性细胞因子IL-4、IL-10的水平。临床研究中抑郁症患者血清中的IL-1、TNF-α等细胞因子水平呈高于普通人群的趋势[23-24]。因此，细胞因子在抑郁症发病中具有重要参考意义。本实验结果也进一步说明补肾疏肝方改善老年抑郁症可能与调节机体免疫功能，进而促进促炎性细胞因子和抗炎性细胞因子的动态平衡有关系。

单胺类递质在抑郁症发病的过程中存在明显的异常[25]。单胺类递质假说认为中枢神经递质的表达以及受体功能的紊乱降低与抑郁症的发生密切相关[26]。海马是重要的脑分区之一，韩兴军等[27]指出抑郁症大鼠海马和尾壳核区中5-HT、DA等水平存在明显降低的情况。谷正松等[28]发现抑郁症患者脑内的5-HT、NE等单胺类神经通路功能存在降低情况，与抑郁症的发生有密切的关系，因而提高其脑内相关单胺类递质的水平即可改善抑郁症。海马中枢神经中的5-HT、NE、DA等水平失衡与抑郁症的产生密切相关[29]。海马结构位于颞叶内侧面的基底部，属于大脑的边缘系统，含有大量单胺类神经递质，能通过组合感受信息、解释环境信息及支配行为以及神经内分泌反馈等对应激反应作出敏锐的回应[30]。目前大量的研究也已经证实，抑郁症患者海马普遍出现损害，表现为体积缩小、功能损伤和神经细胞凋亡增加等[31-34]。通过应用高效液相色谱技术及核磁共振技术都能佐证抑郁症患者海马出现损害的情况[35]。本次实验中补肾疏肝方组大鼠在用药后与模型组相比较其海马中单胺类递质NE、DA和5-HT的水平提高，说明补肾疏肝方能在一定程度上调节单胺类神经递质的分泌和水平。

综上所述，补肾疏肝方具有降低老年抑郁症大鼠血清促炎性因子水平，提高血清抗炎性细胞因子和海马单胺类神经递质水平从而达到抗抑郁作用。此次实验为进一步研究补肾疏肝方的抗老年抑郁症作用和机制奠定基础，为补肾疏肝方应用于临床治疗老年抑郁症提供了理论依据。