枳实标准汤剂质量研究

耿彦梅，高 晗，李雪利，田 方，孙福仁，曾永祯，李军山,2

(1.神威药业集团有限公司，河北石家庄 051430；2.楚雄神威施普瑞药物研究有限公司，云南楚雄675000)

枳实为芸香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培变种或甜橙CitrussinensisOsbeck的干燥幼果，于5—6月收集自落的果实，除去杂质，自中部横切为两半，晒干或低温干燥(较小者直接晒干或低温干燥)而成。枳实为常用中药，其性苦、辛、酸、温，归脾、胃经，能够破气消积、化痰散痞，用于治疗积滞内停、痞满胀痛、大便不通、胃下垂、脱肛、子宫脱垂等症[1]。

枳实主要成分为黄酮、生物碱、挥发油等，其具体成分随原植物、部位而异。酸橙果实含橙皮苷(hesperidin)、新橙皮苷(neohesperidin)、柚皮苷(naringin)、辛弗林(synephrine)、N-甲基酪胺(N-thyltyramine)等；未成熟果皮含柚皮苷、野漆树苷(rhoifolin)、忍冬苷(lonicerin)、新橙皮苷等；在果实成熟时新橙皮苷消失[2-6]。

枳实具有广泛的药理作用，如维生素P样作用、抗炎、抗菌、抗病毒、抗癌、抗溃疡、抑制毛细血管脆性等；对心血管系统、胃肠平滑肌、子宫、泌尿系统、中枢系统等均有一定的药理作用[7-10]。

日本于20世纪60年代开始“汉方药”颗粒研究，80年代纳入国民健康保险范围；韩国20世纪90年代初开始生产中药颗粒；在新加坡等国，配方颗粒已基本取代中药饮片。中国配方颗粒发展正在逐步规范化，2019年11月，国家药监局综合司公开征求《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求(征求意见稿)》意见，这对促进中药配方颗粒标准统一、规范中药配方颗粒生产、推进中医药现代化进程具有重要意义。随着中药配方颗粒研究的日益深入，中药配方颗粒必将成为中药发展的重要组成部分。

中药配方颗粒是由单味中药饮片经水提、分离、浓缩、干燥、制粒而成的颗粒，在中医理论指导下，按照中医临床处方调配，供患者冲服使用，其临床效应应当和相应饮片保持一致。中药饮片是中医药发挥临床疗效的重要药用物质，其安全性、有效性已得到广泛认可。为使中药配方颗粒能够承载中药饮片的安全性、有效性，需要以标准汤剂为桥接，该标准汤剂为衡量中药配方颗粒是否与临床汤剂基本一致的物质基准[11]。

截至目前，对枳实饮片的化学成分及特征图谱的研究已经比较透彻，但对枳实标准汤剂的研究寥寥无几[12-15]。笔者选择了15批不同产地枳实饮片制成的标准汤剂，建立了枳实标准汤剂中辛弗林含量、特征图谱测定方法，对它们的制备、出膏率、主成分含量及含量转移率、特征图谱等进行研究，以期为枳实配方颗粒的质量标准研究提供基础依据，同时为批量生产优质、稳定枳实配方颗粒提供产地参考。

1 主要仪器与材料

1.1 仪 器

LC-20A型高效液相色谱仪，InertSustain AQ-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5.0 μm)(日本岛津公司提供)；分析天平(0.000 01 g，德国赛多利斯公司提供)；JM-A5002电子天平(0.01 g，余姚市纪铭称重校验设备有限公司提供)；水循环真空泵(上海申生科技有限公司提供)；DHG-9140A热风循环鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司、太仓精宏仪器设备有限公司提供)；KH3200E型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司提供)。

1.2 试 剂

辛弗林对照品，批号为110727-201809，纯度为99.5%；橙皮苷对照品，批号为110721-201818，纯度为96.2%；新橙皮苷对照品，批号为111857-201804，纯度为99.4%，均由中国食品药品检定研究院提供。甲醇、乙醇，均为分析纯，由天津市科密欧化学试剂有限公司提供；水为自制纯化水；磷酸为HPLC级，由美国ACS恩科化学公司提供。

1.3 饮 片

15批枳实饮片经原河北省药品检验研究院孙宝惠主任鉴定为芸香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培变种的干燥幼果。样品详细信息见表1。

表1 枳实饮片产地批号信息Tab.1 Origin and batch number information of Aurantii Fructus Immaturus decoction pieces

2 实验部分

2.1 标准汤剂的制备

2.1.1 制备方法

1)煎煮 取枳实饮片50 g于煎药壶中，第1次加饮片量8倍饮用水，浸泡30 min，加热煎煮30 min，药液趁热过300目(48 μm，下同)滤布，第2次加饮片量6倍饮用水，煎煮20 min，药液趁热过300目滤布，合并2次煎液。

2)浓缩 将提取液放入旋转蒸发仪中低温(65 ℃)浓缩至生药量与药液体积比为1∶3。

3)干燥 采用冷冻干燥，将浓缩液摇匀倒入不锈钢盘中(注意确保盘内浓缩液薄厚一致，一般不超过0.5 mm)，放于冷冻干燥机内，进行干燥，即得枳实标准汤剂。

2.1.2 制备工艺验证

取枳实饮片(批号20010816)6份，每份50 g，按照2.1.1进行标准汤剂制备，测定出膏率及辛弗林含量，验证信息见表2。

表2 工艺验证信息Tab.2 Information of process validation

由表2可看出，6批饮片出膏率及辛弗林含量RSD均小于10%，说明此工艺稳定。

2.1.3 15批枳实标准汤剂的制备

分别取15批不同产地、不同批号的枳实饮片按2.1.1项下的制备方法进行制备，即得15批枳实标准汤剂。

2.2 辛弗林的色谱分析

实验选用InertSustain AQ-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5.0 μm)，流动相为甲醇-磷酸二氢钾溶液(体积比为50∶50，取磷酸二氢钾0.6 g，十二烷基磺酸钠1.0 g，冰醋酸1 mL，加水溶解并稀释至1 000 mL)等度洗脱，流速为1.0 mL/min，检测波长为225 nm，柱温为28 ℃，进样量为10 μL，进行色谱分析。

2.2.1 对照品溶液的制备

取辛弗林对照品适量，精密称定。加纯化水制成每1 mL含30 μg的溶液，即得(10 ℃以下保存)。

2.2.2 供试品溶液的制备

取枳实标准汤剂膏粉适量，研细，取约0.2 g，精密称定。置具塞锥形瓶中，精密加入95%乙醇25 mL，称定质量，超声20 min，放冷，再称定质量，用95%乙醇补足减失的质量，摇匀，过0.45 μm滤膜，即得。

2.2.3 方法学考察

1)专属性考察

使用空白溶剂作为阴性对照，通过对照品溶液指认枳实标准汤剂样品中辛弗林峰(参照峰)，进行专属性试验，见图1。在辛弗林出峰位置处，阴性样品未见有明显干扰，说明本方法的专属性良好。

图1 枳实标准汤剂的色谱图Fig.1 Chromatogram of Aurantii Fructus Immaturus standard decoction

2)线性考察

精密称定辛弗林对照品7.52 mg，置250 mL容量瓶中，加纯化水稀释至刻度，摇匀，备用。分别吸取上述储备液1，2，4，6，8，10 mL于20 mL容量瓶中，加纯化水稀释至刻度，摇匀，备用。分别吸取以上各对照品溶液10 μL注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，以辛弗林含量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线(见图2)，回归方程为y=453x+317.2，R=0.999 99，表明辛弗林在0.015 0～0.150 4 mg/g范围内线性关系良好。

图2 辛弗林的线性关系考察Fig.2 Linear investigation of Synephrine

3)准确度考察

精密称取枳实标准汤剂(批号为20010816，质量分数为11.33 mg/g)6份，每份约0.1 g，精密加入一定量的辛弗林对照品溶液，按上述供试品溶液制备方法制备，精密吸取供试品溶液10 μL，以上述色谱条件测定，结果辛弗林的平均回收率为100.20%(n=6)。

4)精密度考察

取枳实膏粉按2.2.2项下制备方法制备供试品1份，重复测定6次，得到枳实标准汤剂中辛弗林的平均含量为2.42 mg/g(质量分数，下同)，RSD为0.63%，表明仪器符合精密度要求。

5)重复性考察

取枳实膏粉按2.2.2项下制备方法平行制备供试样品6份，测定枳实标准汤剂中辛弗林的平均含量，结果为2.43 mg/g，RSD为1.26%，符合2015年版《中华人民共和国药典》的规定(≤1.5%)。

6)稳定性考察

取2.2.2项下供试品分别在0，3，6，9，12 h测定辛弗林的含量，枳实标准汤剂膏粉供试品在12 h内的辛弗林平均含量为2.40 mg/g，RSD为1.21%，表明供试品在12 h内稳定。

2.3 特征图谱的测定

实验选用InertSustain AQ-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5.0 μm)，流动相为甲醇(A)-磷酸二氢钾溶液(B)(取磷酸二氢钾0.6 g，十二烷基磺酸钠1.0 g，冰醋酸1 mL，加水溶解并稀释至1 000 mL)梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，检测波长为225 nm，柱温为28 ℃，进样量为10 μL，测定特征图谱。梯度洗脱程序详见表3。

表3 梯度洗脱程序Tab.3 Gradient elution procedure

2.3.1 对照品溶液制备

取辛弗林对照品适量，精密称定，加水制成每1 mL含30 μg的溶液，即得；取橙皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含40 μg的溶液，即得；取新橙皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含柚皮苷和新橙皮苷80 μg的溶液，即得。

2.3.2 供试品溶液制备

同2.2.2。

2.3.3 方法学考察

1)精密度考察

取枳实膏粉按2.2.2项下制备方法制备供试品1份，重复测定6次，6次测定枳实标准汤剂中各峰的RSD均小于1.0%，说明此方法精密度良好，仪器符合精密度要求。

2)重复性考察

取枳实膏粉按2.2.2项下制备方法平行制备供试样品6份，6次测定枳实标准汤剂中各峰的RSD均小于1.0%，说明此方法重复性良好，符合2015年版《中华人民共和国药典》的规定(≤1.5%)。

3)稳定性考察

取2.2.2项下供试品分别在0，3，6，9，12 h测定特征图谱，结果显示，在12 h内各峰的RSD均小于1.0%，表明供试品在12 h内较稳定。

3 结果及分析

3.1 15批枳实标准汤剂辛弗林含量测定

取15批枳实标准汤剂膏粉，分别按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.2项下色谱条件测定。结果如表4所示。

表4 15批标准汤剂中辛弗林含量及含量转移率(n=2)Tab.4 Synephrine content and content transfer rate in 15 batches of standard decoction(n=2)

3.2 辛弗林含量及含量转移率结果分析

15批枳实标准汤剂出膏率均值为15.14%，RSD为19.31%，表明不同产地枳实的出膏率差异较大，范围为10.50%～19.91%；辛弗林含量均值为9.07 mg/g，RSD为33.05%，表明不同产地枳实的辛弗林含量差异较大，范围为5.92～15.21 mg/g；辛弗林含量的转移率均值为22.65%，RSD为45.92%，表明不同产地枳实间的辛弗林含量转移率差异较大，范围为10.24%～47.70%，辛弗林含量转移率差异较大主要是因为不同产地枳实的出膏率及含量差异较大引起的。

综合出膏率、辛弗林含量及含量转移率，可知湖南的永州、常德，江西的井冈山、景德镇等地的枳实质量较佳。

3.3 15批枳实标准汤剂特征图谱测定

取15批枳实标准汤剂膏粉，分别按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.3项下色谱条件进行测定，结果如图3、图4所示。

图3 枳实标准汤剂HPLC对照图谱Fig.3 HPLC control of Aurantii Fructus Immaturus standard decoction

图4 15批枳实标准汤剂HPLC图谱Fig.4 HPLC spectrum of 15 batches of Aurantii Fructus Immaturus standard decoction

3.4 特征图谱结果分析

比对15批枳实标准汤剂膏粉特征图谱，共得到7个共有峰，其相对峰面积见表5，可以看出峰面积的RSD差异较大，表明不同产地、不同批次枳实间的化学成分含量存在较大差异；而相对保留时间(见表6)的RSD都比较小，表明出峰时间比较稳定；特征图谱相似度的比对结果见表7。与对照谱图比对，相似度为0.655～0.936，总体来说不同产地、不同批次间枳实标准汤剂膏粉的特征图谱与对照特征图谱相似度欠佳，表明枳实标准汤剂各产地、各批次间的化学成分种类及含量差异较大。

表5 15批枳实标准汤剂特征图谱相对峰面积Tab.5 Relative peak areas of characteristic spectrum of 15 batches of Aurantii Fructus Immaturus standard decoction

表6 15批枳实标准汤剂特征图谱相对保留时间Tab.6 Relative retention time of characteristic spectrum of 15 batches of Aurantii Fructus Immaturus standard decoction

表7 15批枳实标准汤剂特征图谱相似度Tab.7 Similarities of characteristic spectrum of 15 batches of Aurantii Fructus Immaturus standard decoction

4 结 语

本研究通过选取具有代表性的15批不同产地的枳实饮片制成的标准汤剂，建立了枳实标准汤剂中辛弗林含量、特征图谱的测定方法，此方法已通过方法学验证，具有较高的稳定性，可用于枳实标准汤剂的质量研究。

15批枳实标准汤剂出膏率均值为15.14%，范围为10.50%～19.91%；辛弗林含量均值为9.07 mg/g，范围为5.92～15.21 mg/g；辛弗林含量的转移率均值为22.65%，范围为10.24%～47.70%。综合出膏率、辛弗林含量及含量转移率，可知湖南永州、常德，江西井冈山、景德镇等地的枳实质量较佳。

本次研究选取4个产地的枳实药材为研究对象，其中江西为道地产区，其余产地为主产区。标准汤剂研究发现，枳实标准汤剂含量、含量转移率的RSD分别为33.05%，45.92%，表明不同产地间枳实中的辛弗林含量差异较大，需要收集更多批次样品进行研究，以确保枳实标准汤剂更具代表性、适用性。今后将会收集更多主产区不同批次的样品，进一步补充完善枳实标准汤剂的相关数据。