如何减少冷冻切片中的类冰晶现象

林兴滔，葛 岩，邓雪琴，郭寿铭，李 智

术中冷冻切片快速病理诊断是协助临床医师明确病变性质、指导手术方式和范围的重要依据。由于冷冻切片技术、取材范围有限和报告时间短等问题，易导致病理医师延迟诊断，甚至是误诊。高质量的冷冻切片是病理医师准确发出术中快速病理诊断的基础。笔者在临床实践操作中观察到部分冷冻切片组织结构扭曲、细胞挤压变形，存在类冰晶现象，而冰对组织石蜡切片中未见此类现象。本实验旨在探讨切片类冰晶现象产生的原因及解决方法，以进一步提高冷冻切片的质量。

1 材料与方法

1.1 材料收集2020年8月广东省人民医院病理科行术中冷冻切片病理诊断标本30例，包括甲状腺、乳腺、肺、脑、肝脏、卵巢和淋巴结组织。

1.2 仪器与试剂德国Leica CM1960恒温冷冻切片机，全自动冷冻染色机，OCT冷冻包埋剂，电冷热吹风筒(1 kw)，冷甲醇50 mL，Lillie-Mayer苏木精，水溶性伊红Y，1%碳酸锂溶液，耐确冷冻染色机NQ200S。

1.3 方法根据组织大小选取不同规格的夹头，根据冷冻组织类型设置箱体温度，使组织保持合适的硬度。将样本支持器平稳放置在速冻台上，滴加少许OCT包埋剂让其硬化，将规范取材(厚度≤3 mm)的术中冷冻新鲜组织放在其表面，用OCT包埋胶完全包裹，组织变硬后即可切片，6～8 μm厚[1]。实验分成两组：(1)人为冰晶组，新鲜组织块浸泡于生理盐水15 min后，不吸干水分直接冷冻切片。(2)实验组，新鲜组织用纸巾吸干表面水分后冷冻切片。2组病例均冷冻切片8张，分别进行4种不同操作方法处理：A.切片后即刻入冷甲醇固定1 min后直接水洗，再行进行性HE染色；B.切片后即刻入冷甲醇固定1 min后冷风吹干20 s，水洗后行进行性HE染色；C.切片分别室温自然晾干1、2、4、8和16 min，入冷甲醇固定1 min，水洗后行进行性HE染色；D.切片后冷风吹干20 s后入冷甲醇固定1 min，水洗后行进行性HE染色。冷冻组织切片后置于10%中性福尔马林固定24～48 h，常规脱水、透明、浸蜡，包埋，4 μm厚切片，并行HE染色。

1.4 结果评估对切片整体、组织结构、细胞形态、胞核染色质及核质比进行评估。

2 结果

人为冰晶组冷冻切片经4种方法处理后，HE切片中产生的冰晶无法消除(图1、2)，冰对组织HE切片仍可见冰晶。

实验组新鲜组织冷冻切片后立即置于冷甲醇中固定(A和B法)，组织细胞均发生不同程度收缩，胞核深染，核质比改变，间质纤维收缩，特别是细胞稀疏、含水分多及间质疏松的组织改变较明显。乳腺导管细胞收缩明显、重叠。肺泡间隔缩小、结构变形。脑组织细胞间产生空洞、胞核深染扭曲。细胞丰富、含水分较少及间质紧致的组织则改变不明显。卵巢及甲状腺胞核收缩，部分腺泡上皮细胞紧密，腺泡及腺泡间结构尚佳。肝细胞核稍收缩，血管周围及间质收缩。淋巴结淋巴细胞胞核略收缩、染色质清晰。

实验组冷冻切片经C法(自然晾干1、2、4、8和16 min)处理，晾干1、2 min冷冻切片细胞核结构清晰，染色质明显，细胞形态正常，组织结构未发生变形(图3、4)；而晾干4、8、16 min冷冻切片细胞发生肿胀，核膜及染色质淡染、模糊。实验组冷冻切片经D法处理与C法室温晾干4 min结果相似。

①②③④

3 讨论

冷冻切片制片质量不佳是术中快速病理诊断发生延迟和误诊的重要原因，如切片厚、脱水透明不佳、冰晶等[2-4]。冷冻切片的制作是新鲜组织不经脱水、透明等处理，快速冷冻到一定硬度后进行切片染色的过程。每一步骤均可对冷冻切片质量产生影响，包括标本送检、取材(≤3 mm)、冷冻的温度和速度、固定液选择和固定时间等[1]，其中冰晶现象是临床及科研工作中备受关注的问题。

未固定的新鲜组织冷冻温度下降缓慢，组织细胞的水分便会形成粗大冰晶，挤压周围的细胞或间质成分，影响组织细胞的形态结构。笔者在实践工作中也观察到某些组织类型的冷冻切片迅速固定后出现类似冰晶现象，而在冰对组织石蜡切片中无此现象。冯家成等[5]报道脑组织冷冻切片立即置于固定液，切片呈网格状，经室温放置2 min或电热吹风30 s后固定组织切片网格消失。传统的观念认为及时固定是冷冻切片制作的第一要素，而作者观察组织冷冻切片即刻固定后，均发生不同程度的细胞和间质的收缩，特别在细胞稀疏、含水分多及间质疏松的组织中更易发生细胞紧密重叠、细胞核变形，疏松结缔组织收缩牵拉导致腺体及导管的扭曲和腺腔消失等；而在细胞丰富、含水分较少及间质紧致的组织中类冰晶现象较少见。《临床技术操作规范·病理学分册》中提到冷冻切片贴附于载玻片后需稍干才置于固定液中，但无确切的干燥时间可供参考。本实验将冷冻切片分别于室温干燥1、2、4、8和16 min置于冷甲醇中固定，发现室温干燥1、2 min后，冷冻切片的类冰晶现象得到改善，组织细胞的形态结构接近于石蜡切片，而冷冻切片经4、8、16 min室温干燥后细胞均肿胀、变性且耗时过长，无法满足术中冷冻快速、准确的要求。

术中快速病理诊断具有时限性(从取材到发出报告<30 min)，干燥时间过长会延缓报告发出，影响临床医师及时为患者提供下一步治疗。因电热风干燥处理会导致细胞的收缩、形态结构的改变，应考虑用冷风加速冷冻切片的干燥速度。然而在冷风干燥20 s后，冷冻切片出现细胞胞质肿胀、胞核淡染、间质增宽等变性表现。文献报道[6]组织应即刻固定，否则细胞不可避免的存在一定程度的破坏。本实验尝试将冷冻切片即刻固定于冷甲醇1 min后，再使用冷风干燥20 s，发现其并不能改善类冰晶现象。

为了观察冷冻切片中的真冰晶是否可通过室温或者冷风干燥的方式消除，本实验将新鲜组织浸泡于生理盐水15 min，使大量水分子进入组织，人为地造成冷冻切片冰晶效果。其冷冻切片的大量冰晶经室温干燥1、2、4、8、16 min及冷风干燥20 s后，仍可见大量空洞、间质及细胞挤压的现象，结果提示组织在发生冰晶后难以恢复其正常的结构及细胞形态。

新鲜组织经过急速冷冻，如贴片后即刻放入固定液，组织中细胞及结缔组织仍保持收缩状态，特别是细胞稀疏、含水分多及间质疏松的组织收缩程度更明显。通过热胀冷缩的原理，本实验发现冷冻切片在室温干燥1、2 min时，收缩状态的组织细胞逐渐恢复正常形态结构，减少或避免了细胞形态扭曲、胞核变形和组织结构的变化，更好地体现组织细胞的生活状态，有利于病理医师发出准确的术中快速病理诊断报告。