前列腺癌组织中Plexin-B1的表达及其与AR表达的相关性

盛仁明，侯 燕，刘加豪，张永胜，涂 健

前列腺癌是男性常见的恶性肿瘤，早期前列腺癌局限于前列腺内，预后较好，若发生转移较难诊治。AR信号传导对前列腺癌的进展至关重要，去势治疗是前列腺癌的重要治疗手段，而去势抵抗性前列腺癌是患者发生耐药及死亡的重要原因[1]。Plexin-B1是信号素Sema4D的跨膜受体[2]，其在前列腺癌中通过Sema4D/Plexin-B1信号通路激活HER-2以及雄激素受体，促进肿瘤的侵袭性[3]。本实验采用免疫组化EnVision法染色、qRT-PCR法检测Plexin-B1 蛋白和mRNA在前列腺癌和良性前列腺组织中的表达，分析其表达水平与前列腺癌临床病理学特征及预后的关系，为临床与病理医师提供参考。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2009年1月～2011年1月苏州大学附属第二医院病理科存档的82例前列腺癌组织和46例良性前列腺组织，前列腺癌的组织学类型均为腺泡腺癌。82例前列腺癌患者年龄55～94岁，平均72.9岁，>70岁者51例，≤70岁者31例。按照AJCC(2017)分期标准进行分期：Ⅰ+Ⅱ期者35例，Ⅲ+Ⅳ期者47例；有淋巴结转移者20例。患者均经手术切除治疗，术前均未行放、化疗或抗雄激素等治疗。按WHO/ISIP(2016)分级分组系统[4]将前列腺癌分为1～5组。82例前列腺癌患者随访3～120个月。

1.2 试剂Plexin-B1兔抗人抗体购自Abcam公司，AR的兔抗人多克隆抗体购自武汉博士德生物公司。免疫组化检测试剂盒、DAB显色剂均购自北京中杉金桥公司。Trizol提取试剂盒购自上海宏生生物公司，qRT-PCR扩增试剂盒购自南京诺唯赞生物公司。

1.3 免疫组化标本均经10%中性福尔马林固定，常规脱水，透明，石蜡包埋，3 μm厚连续切片。免疫组化染色采用EnVision法，一抗包括Plexin-B1(1 ∶200)、AR(1 ∶300)，4 ℃孵育过夜，具体操作步骤严格按试剂盒说明书进行。用PBS代替一抗作为阴性对照，用已知阳性染色的前列腺癌切片作为阳性对照。

Plexin-B1阳性结果判断参考文献[5-6]进行：(1)按阳性细胞染色程度计分：不着色或显色不清为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；(2)按阳性细胞百分比计分：阳性细胞数<10%为1分，10%～50%为2分，>50%为3分。将两项得分结果相乘：总分<3分为阴性(-)，≥3且<6分为阳性(+)，≥6分为强阳性()。

1.4 qRT-PCR采用Trizol试剂盒提取20对前列腺癌和良性前列腺组织的总RNA，然后逆转录为cDNA，采用qRT-PCR检测Plexin-B1 mRNA基因的表达。Plexin-B1引物序列：上游5′-GGCGAGGATA CACCAGCAG-3′，下游5′-GTGCAAAGGCACTCACG AA-3′。内参β-actin引物序列：上游5′-CACCATTG GCAATGAGCGGTTCC-3′，下游5′-GTAGTTTCGTG GATGCCACAGG-3′。反应条件：95 ℃ 10 min、95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，合计40个循环；进行熔解曲线检测。每个样本设3个复孔，实验重复3次。采用2-ΔΔCt法计算相对表达量。

1.5 统计学分析所有数据应用SPSS 24.0软件进行统计学分析。计数资料率的比较采用χ2检验。Kaplan-Meier法绘制生存曲线，配对资料的比较采用配对t检验，采用Spearman进行相关性分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 前列腺癌和良性前列腺组织中Plexin-B1的表达Plexin-B1阳性呈棕黄色或棕褐色颗粒，主要定位于细胞胞核，胞质浅着色，间质细胞未着色。前列腺癌组织中Plexin-B1的阳性率为74.39%(61/82)。良性前列腺组织中Plexin-B1的阳性率为10.87%(5/46)。前列腺癌组织中Plexin-B1阳性率显著高于良性前列腺组织，两组相比差异有统计学意义(P<0.01，表1，图1)。

表1 前列腺癌和良性前列腺组织中Plexin-B1的表达

AB

2.2 前列腺癌组织中Plexin-B1的表达及与临床病理特征的关系临床分期Ⅰ+Ⅱ期前列腺癌中Plexin-B1的阳性率为61.54%，Ⅲ+Ⅳ期前列腺癌中Plexin-B1的阳性率为86.05%，差异有统计学意义(P=0.021)。WHO/ISUP(2016)分级分组中1～5组前列腺癌的Plexin-B1蛋白阳性率分别为75.00%、70.00%、60.00%、83.33%、82.35%，5组之间差异有统计学意义(P=0.005)，Plexin-B1蛋白表达与患者年龄、淋巴结有无转移、脉管及神经有无侵犯等均无关(P>0.05，表2)。

表2 前列腺癌组织中Plexin-B1的表达及与临床病理特征的关系

2.3 前列腺癌及良性前列腺组织中Plexin-B1 mRNA的表达qRT-PCR检测20对前列腺癌和良性前列腺组织，结果显示：Plexin-B1 mRNA相对表达量在前列腺癌中为(267.15±57.06)%，在良性前列腺组织中为(100.00±19.02)%。这提示Plexin-B1 mRNA在前腺癌组织中的表达水平高于良性前列腺组织，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4 Plexin-B1表达与前列腺癌患者预后的关系Kaplan-Meier生存曲线分析显示，Plexin-B1高表达组10年生存率为55.74%，Plexin-B1低表达组10年生存率为85.71%。结果表明，前列腺癌组织中Plexin-B1高表达组的生存率低于Plexin-B1低表达组，差异有统计学意义(P=0.019，图2)。

图2 Kaplan-Meier生存曲线分析Plexin-B1表达与前列腺癌患者预后的关系

2.5 前列腺组织中Plexin-B1与AR表达的相关性免疫组化检测Plexin-B1和AR在前列腺癌组织中的表达，结果显示：Plexin-B1阳性组AR阳性率为86.89%，Plexin-B1阴性组AR阳性率为61.90%。Spearsman等级相关分析显示，Plexin-B1与AR的表达呈正相关(r=0.275，P=0.012，表3)。

表3 前列腺癌组织中Plexin-B1和AR表达的相关性

3 讨论

脊椎动物中Plexin蛋白家族有9个成员，分成4个亚组，包括：Plexin-A、Plexin-B、Plexin-C、Plexin-D；其中Plexin-B有3个成员：Plexin-B1、Plexin-B2和Plexin-B3。Plexin-B1属于跨膜蛋白分子，其由2 315个氨基酸组成，mRNA长7 097 bp，其cDNA长6 467 bp[7]。研究证实Plexin-B1在恶性胶质瘤、乳腺癌、卵巢癌、鳞状细胞癌等肿瘤中高表达，并促进肿瘤的发生、发展[8-9]。文献报道，Plexin-B1蛋白作为Sema4D的受体在多种肿瘤的侵袭、转移以及血管新生等方面发挥重要作用[10-11]。目前，Plexin-B1与前列腺癌的相关性尚未见报道。本实验结果表明，Plexin-B1在前列腺癌细胞膜、胞质和胞核中高表达，尤以细胞核的表达水平最高，提示Plexin-B1可能在前列腺癌中起作用。

研究表明，在前列腺癌中Plexin-B1基因突变导致Plexin-B1介导的相关通路缺失抑制了肿瘤细胞的侵袭性[12-15]。在前列腺癌中Plexin-B1可以通过激活癌基因HER-2和c-Met调节小GTP酶RhoA、R-Ras和Rap1b与Rac、Rnd和RhoD相互作用，导致肌动蛋白细胞骨架和细胞的活动[16-17]。在晚期前列腺癌中Sema4D/Plexin-B1信号通路可能通过激活HER-2和Plexin-B1基因突变，促进前列腺癌的侵袭性，该过程与在乳腺癌中的过程相似[18-19]。本实验发现，Plexin-B1在前列腺癌组织中的表达水平高于正常前列腺组织，差异有统计学意义。采用qRT-PCR检测20对前列腺癌组织和良性前列腺组织，结果表明：Plexin-B1 mRNA在前腺癌组织中的表达水平高于良性前列腺组织，提示Plexin-B1在前列腺癌中表达水平出现异常，其可能导致了前列腺癌的发生、发展。

本实验进一步分析Plexin-B1的表达和前列腺癌临床特征及预后的关系，结果表明：Plexin-B1在前列腺癌组织中过表达，与临床分期、WHO/ISUP密切相关。生存分析结果表明Plexin-B1高表达的患者总生存率低于低表达患者。文献报道Plexin-B1可以通过一系列通路，促进PI3K、AKT、ERK/MAPK等分子磷酸化状态发生变化，使前列腺癌细胞骨架结构发生改变，并导致肿瘤的迁徙、侵袭能力增强，促进肿瘤的转移[20]。在乳腺癌中Plexin-B1可以通过解离淋巴管间质促进癌细胞的扩散，从而导致患者预后不良[21]。本实验结果与文献报道相符，其机制还有待于进一步分析。

AR信号通路在前列腺癌中发挥重要作用，去势治疗是治疗进行性前列腺癌的标准疗法。而去势抵抗前列腺癌对该疗法的抵抗产生了与配体无关的AR信号，其必须进入细胞核作为转录因子激活基因转录才能发挥作用[22]。因此，AR到细胞核的过程是潜在治疗靶点，成为近年研究热点。研究表明，多西紫杉醇和强的松治疗的去势抵抗治疗使前列腺癌患者的生存率明显增加，其与微管蛋白结合并抑制微管依赖性AR向细胞核的转运[23]。研究表明Plexin-B1信号通路可能通过促进AR向细胞核的转运，促进前列腺癌的发生、发展[24]。

本实验结果表明Plexin-B1和AR的蛋白表达水平具有相关性，其相互作用，可能促进肿瘤的发生、发展。Plexin-B1蛋白作为Sema4D的受体[25]在前列腺癌进展中具有重要作用，有望成为新治疗靶点。Plexin-B1在前列腺癌中具体生物学机制仍需要进一步分析，可能提高前列腺癌患者的早期诊断效率，有望成为靶向治疗的新靶点。