梨火疫病检测技术研究与推广应用

董 欢

（新疆维吾尔自治区农业农村厅哈密植物检疫工作站，新疆 哈密 839001）

梨火疫病是由噬淀粉欧文氏菌（Erwinia amylovora）引起的一种极具毁灭性的细菌性病害，可危害包括梨、苹果、山楂、李等在内的40 多个属、220 多种蔷薇科植物。风、雨、鸟类、昆虫均对该病有一定传播扩散作用，远距离传播途径主要为感病寄主的种苗、接穗、砧木等繁殖材料以及被污染的包装材料、运输工具等。目前梨火疫病在北美、中美、欧洲、西亚等多国均有分布，是《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物》中规定的一类危险性病害。

一、梨火疫病检测技术

梨火疫病极具毁灭性，世界各国及地区均将该病的快速、准确检测技术列为重要研究课题，旨在通过灵敏、准确的检测技术降低该病通过贸易流通传入国内的机率。

1、传统检测技术

（1）选择性培养基法

选择性培养基是一种传统的梨火疫病菌检测方法，常通过多种培养基结合使用以达到精准检测和鉴定目的。基本原理是根据梨火疫病菌在不同培养基上呈现出的菌落特征、颜色达到快速鉴定的目的。多以半选择性培养基为主，各类培养基均有不同优缺点。MS 培养基上的菌落为橙红色，边缘光滑透明；但该配方复杂，不易储存。CG 培养基成分简单，但菌落形成特征不稳定，菌落识别需要一定经验。TTC 培养基上的菌落为独特的红色肉瘤状，易识别。CCT 培养基上菌落为黄色带蓝色边缘菌落，常用于检测无症状苹果花、芽和溃疡斑上的梨火疫病菌。Zeller 改良培养基经设计改良配方简易，但易与在该培养基上的某些菌落混淆。

（2）致病性测定

检测分离得到的梨火疫病菌通常需要进行致病性测定。一般采用幼梨或幼苗测定分离物的致病性，特征性明显的菌脓则视为梨火疫病菌。张乐等利用离体巴梨枝条测定梨火疫病菌的致病性，接种的枝条在28℃条件下保湿培养，如果是梨火疫病菌，60 h 后可见接种孔有白色菌脓流出，若接种孔干燥则不是梨火疫病菌[1]。

（3）免疫学检测技术

应用于植物病原细菌的免疫学检测技术主要为酶联免疫分析技术、免疫荧光技术、玻片凝集技术、免疫分离等。检测结果获得时间相对较短，但会受限于血清质量和专化性。谢洪芳等[2]将半选择性培养基与常规免疫方法相结合，使检测灵敏度达到了每毫升10～100 个细胞。胡白石等[3]建立的膜上免疫分离技术成功对梨火疫病菌进行了检测，提高了可操作性。2003 年胡白石等[4]利用梨火疫病菌脂多糖制备了抗血清，建立了间接免疫荧光染色法和协同凝集法检测梨火疫病菌，具有耗时短、转化性好的特点，适合口岸工作需求。

2、分子检测技术

PCR 检测技术自建立起就被广泛应用于微生物专化和灵敏度检测。随着方法学的发展进步，PCR 技术在传统应用基础上与其他技术相结合，衍生出灵敏度更高、专化性更好的检测技术。

（1）PCR 技术

1996 年，谢云陆[5]建立了聚合酶链式反应（PCR）检测梨火疫菌技术，梨火疫菌检出最低带菌量为50 个。PCR 技术具有特异、灵敏和快速的特点，但影响因素较多，直接影响扩增结果。

（2）实时荧光PCR 技术

2006 年，钱国良、胡白石等[6]根据梨火疫病菌16～23 S间的ITS 保守序列，设计合成一对特异性引物REA/FEA，应用荧光燃料SYBR Green I，对10 个梨火疫菌株及参试菌株进行检测，成功建立了梨火疫病菌的实时荧光PCR 检测方法，检测灵敏度达到4 个细胞，比常规PCR 电泳检测提高10 倍。

（3）一步双重PCR 法

2008 年许景升等[7]将来自染色体序列的引物和pEA29 质粒序列的引物放在1 个PCR 反应体系中，同时扩增得到1.6 kb 和1.0 kb 的2 条扩增带，建立了快速、准确检测梨火疫病菌的一步双重PCR 技术。该技术弥补了仅依赖pEA29 质粒序列检测方法存在的缺陷，最小检出菌量可达到3 个。而且，此技术可直接采用细菌菌体为模板检测梨火疫病菌，省去了繁琐耗时的DNA提取过程。

（4）免疫捕获（吸附）PCR 检测法

2010 年，何丹丹等[8]利用被包被在PCR 管壁的抗体特异性吸附目的细菌，洗涤除去样品处理液中的大部分PCR 反应抑制物质，建立了梨火疫病菌免疫捕获PCR 方法，检测灵敏度达到了1.5×102cfu/reaction，较PCR 法灵敏度提高10 倍以上，且省去了DNA 提取步骤。同年，苏梅华等[9]同样利用特异抗血清包被PCR 管吸附靶标细菌的原理，建立了免疫吸附PCR 方法。免疫捕获（吸附）PCR 技术准确灵敏，对设备要求不高，极具在口岸一线检疫部门推广使用的潜力。

（5）实时荧光PCR 和诱捕PCR-ELISA 检测方法

2003 年朱建裕等[10]设计了1 对引物和3 条探针，建立了实时荧光PCR 检测方法和诱捕PCR-ELISA 检测方法。实时荧光PCR 采用带荧光标记的核酸杂交探针，避免了假阳性和交叉污染。诱捕PCR-ELISA 检测方法只需简单处理的样品就能检测，由于增加了核酸杂交探针，故不需凝胶电泳EB 染色检测，避免了假阳性问题。

3、多光谱遥感技术

2020 年Nikrooz Bagheri[11]提出了利用多光谱遥感技术对梨园的叶绿素含量和树冠密度进行测定，采用地面多光谱成像技术对健康树木叶片、无症状病叶和有症状病叶进行成像研究。树冠的航空多光谱成像则利用无人机完成，然后对地面和空中图像进行预处理和处理。通过计算某些植被指数来检测感染叶片，分类总体准确率达到95.0%，是一种可靠的早期检测梨火疫病的方法。

二、快速检测方法及其应用

罗明、袁英哲等人2020 年6 月5 日发明专利申请：一种快速检测梨火疫病菌活菌的方法及应用。该方法的原理是实时荧光定量PCR 检测方法，即根据实时荧光定量PCR 的扩增曲线和获得的Ct 值，确定检测样品中梨火疫病菌的存活状态。当检测样品Ct 值＜35，判定为阳性，即检测样品中含有梨火疫病菌活菌；当Ct值≥35，判定为阴性，即检测样品中不含有梨火疫病菌活菌。该方法可应用于对梨火疫病感病果树枝条、叶片、花、果实中梨火疫病菌活菌的定性和定量检测。

三、结语

梨火疫病是一种极具毁灭性的病害，加强进境植物及其产品、包装材料的检疫，严格落实检疫管理措施，最大限度降低其传入风险，对切实保护全国产业安全具有极为重要的意义。筛选抗病的砧木与接穗、培育优良的抗病品种是对梨火疫病最有效、经济的防控措施。