卵巢早衰动物模型的研究进展

马 瑞，崔晓萍，李祖昂，郑 娜，肖新春

（陕西中医药大学，咸阳 712046）

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是指女性在40岁以前出现闭经、FSH＞40 IU·L-1和雌激素水平降低，并伴有不同程度的围绝经期症状[1-3]的一种疾病。目前该病的发病率占1%～3%[4]，并处于不断上升的状态。导致POF的病因复杂多样，大体上可将其分为遗传因素、环境因素、代谢因素、自身免疫因素、身心应激因素、医源性因素等几大类，该疾病在人体研究困难且卵巢组织难以获取，为进一步研究该疾病的治疗方案，给更多患者带来福祉，许多学者通过建造动物模型来深入研究该疾病的发生、发展及治疗，本文现将能搜集到的造模方法汇集在一起，旨在为更多研究者建立动物模型提供便捷。

1 动物模型建立方法

1.1 化学药物POF造模法

随着恶性肿瘤、免疫性疾病化疗后患者存活率的提高，加之在女性发病逐渐年轻化，药物作用机体后带来的生殖问题也不断涌现，其中以环磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）、顺铂、雷公藤多甙片和氢化可的松对卵巢功能影响较为明显。为提高治疗后育龄期妇女的生育功能和生活质量，多数学者选择用化疗药物来构建POF的动物模型。常用药物及方法如下。

1.1.1 CTX 作为常用化疗药物之一的CTX，具有高度卵巢毒性作用，可作用于细胞DNA而引起DNA单链或双链的断裂，以致DNA、RNA和蛋白质的合成被抑制[5]，损伤性腺组织。Plowchalk[6]等和Meirow[7]等研究发现，CTX对各级卵泡均有破坏作用，其中以原始卵泡破坏最为严重。张娟[8]等将家兔随机分组，分别给家兔注射50 mg·kg-1的CTX 1 d（A组）、50 mg·kg-1连续注射2 d（B组）、按照8 mg·kg-1连续注射14 d（首日注射50 mg·kg-1）（C组）三种方法建立模型。经注射CTX后，模型组体重与对照组相比明显下降，并出现动情周期紊乱，血清学检测、病理学和形态学的改变。其中A组雌激素水平在7 d达高峰，后整体呈下降趋势，但在21 d出现小幅度升高，原因可能由于A组剂量所致卵巢损伤是可逆的，卵巢功能没被彻底破坏。B组雌二醇（E2）值则持续下降，且在注射CTX后第35天降至最低，比较接近临床上POF患者低雌激素表现；C组体重下降迅速，且病死率高，不适宜用作造模。最终得出给家兔注射50 mg·kg-1的CTX，连续2 d是建立POF模型最佳剂量的结论。

赵雪静[9]给2～3月龄SD大鼠连续腹腔注射不同浓度［10、20、30 mg·（kg·d）-1］的CTX 20 d，给药结束后高、中剂量组大鼠的体质量明显下降，动情周期紊乱，动情期及动情前期减少，总周期数较少，主要表现为持续的动情间期；卵巢湿重减轻并出现病理组织、血清学的改变。低剂量组大鼠的病理学和形态学表现则不明显，血清学及动情周期与对照组相比无改变。各组大鼠其他器官均无损伤，也保证了造模过程中大鼠生命体征的平稳，最终得出CTX20mg·（kg·d）-1的实验剂量最符合临床POF的内分泌特征的结论。

1.1.2 雷公藤多甙片 雷公藤多甙是提取自中药雷公藤的一种物质，目前临床多用于治疗类风湿性关节炎、原发性肾小球肾病等自身免疫性疾病，该药长期服用对卵巢功能会有所损害。郝娟等[10]用生理盐水配制的雷公藤多甙片悬浮液给大鼠灌胃50mg·（kg·d）-1，连续14d，自灌药第4天起，每日进行阴道涂片、观察动情周期，2d测1次体质量，给药结束后24h，大鼠给予10%水合氯醛麻醉后眶周取血，处死大鼠后观察到子宫和卵巢的质量均较对照组明显减轻，卵巢病理组织学和血清学检测发生改变；子宫黏膜层明显变薄，腺体减少，肌层变薄；动情周期延长，出现持续的动情间期或动情期延长至3d。

1.1.3 顺铂 顺铂是常用的腹腔化疗药物，其作用类似于烷化剂，主要通过干扰肿瘤细胞的DNA复制、与核蛋白和细胞质蛋白结合来达到治疗肿瘤的作用[11]，在抗肿瘤细胞的同时也对机体全身系统造成损害。齐聪[12]给6周龄大鼠腹腔注射2mg·（kg·d）-1顺铂×5d，总剂量为10mg·kg-1（A组）、4mg·（kg·d）-1×5d（B组）、2mg·（kg·d）-1×10d（C组），B、C两组总剂量均为20mg·kg-1，D组仅注射生理盐水2mL·d-1×10d。其中顺铂溶液（0.5mg·mL-1）经生理盐水稀释为总量2mL一次性腹腔注射。给药后观察到大鼠卵巢的病理学及血清学检测发生改变，剂量大的B、C组更为明显，得出了随着剂量的增大、给药时间的延长，药物对卵巢功能的损伤越大的结论。张丽娟等[13]分别给大鼠腹腔注射4mg·kg-1和6mg·kg-1顺铂注射液，每周1次，连续2周，第2次注射7d后取材。给药过程中观察到大鼠体重有不同程度减轻、行动缓慢，喜蜷缩、弓背，体毛晦暗无光泽，高剂量组更为显著。除此之外，还观察到大鼠卵巢组织的形态学、病理学，血清学检测发生变化。两组大鼠的动情周期出现紊乱，其中低剂量组间期延长，动情期缩短，停药后可有所恢复；而高剂量大鼠则长期停在动情间期，停药后不会恢复，最终得出高剂量组模型更为理想的结论。

1.1.4 氢化可的松 氢化可的松为肾上腺皮质激素类药，常用于肾上腺皮质功能减退症的替代治疗及先天性肾上腺皮质功能增生症的治疗，也可用于类风湿性关节炎、风湿性发热、痛风、支气管哮喘、过敏性疾病及严重感染和抗休克等治疗。其不良反应除了出现库欣综合征外，还可对女性生殖方面产生不利影响。江瑜[14]等对2~3月龄雌性大鼠的后腿肌肉注射氢化可的松（10mg·mL-1），每日注射1次，连续14d，给药后大鼠动情周期紊乱，病理组织及血清学检测均明显改变。王凯[15]等给8~9周龄的雌性大鼠后下肢肌肉注射氢化可的松［32mg·（kg·d）-1］，每日1次，连续12d，给药后大鼠出现精神萎靡、蜷缩、怕冷，毛无光泽、拱背少动，饮食减少，体重减轻，反应迟钝等症状，动情间期持续或延长，卵巢指数降低，血清生殖激素异常，其中促卵泡成熟激素（FSH）/黄体生成激素（LH）在停止造模第1天升高，第15天略有下降。

化学药物造模法成本低，操作简单、方便，容易实施，建立的模型也更为稳定，可控性强，适宜剂量保证了动物生命体征的稳定，目前深受国内研究者们的欢迎，其中CTX应用最为广泛。

1.2 放射疗法POF造模法

放射疗法是利用大量的辐射所产生的能量可破坏细胞的染色体，使细胞停止生长，从而消灭可快速分裂和生长的癌细胞，常作为直接或辅助治疗癌症的方式。有研究发现[16]，放疗在破坏癌细胞时也会损伤各级卵泡，其中以原始卵泡最为敏感。贺宇恒等[17]用RS2000系列生物辐射仪对小鼠进行不同程度（0Gy、2Gy、4Gy、6Gy）的单次全身辐照，剂量率为1.2Gy·min-1，距离为50cm，7d后取材，可观察到小鼠卵巢的损伤程度随着辐射剂量的增加逐渐加重，并得出4Gy剂量是造成小鼠POF的最低适宜剂量。为进一步研究出小鼠造模的最佳时间，又观察4Gy剂量时不同时间点（14d、21d、28d和42d）小鼠的表现：随着辐照时间延长，小鼠动情周期的动情后期和动情间期在总周期所占比例延长，动情期逐渐缩短（正常规律情况下动情后期持续时间10～14h，动情间期持续时间60～70h，动情期持续时间9～15h），42d表现为持续动情间期；卵巢的病理学、形态学改变及血清学检测指标变化更加明显。与0Gy组比较，7d时原始卵泡数下降约85%，14d下降约92%，42d时卵巢内仅剩闭锁卵泡，最后得出小鼠接受单次全身4Gy辐照后7～14d能够建立POF理想模型的结论。该造模方法操作简单，病死率低，容易成功，可重复性强，但与化学药物相比较，该方法成本相对较高，并在干预过程中对其他器官也会产生损伤，影响实验结果的观察。

1.3 自身免疫性POF造模法

1.3.1 透明带（ZP）3多肽（pZP3） ZP是包围在哺乳动物的卵细胞的一层支持其生长的糖基化基质，其中ZP3为其中之一。1992年Rhim等[18]发现，小鼠和人ZP3蛋白具有67%的同一性，且pZP3可诱导小鼠产生抗ZP3抗体，与卵巢ZP3结合引起自身免疫性卵巢炎，从而引起类似于人类POF的表现。朱玲[19]等将由2 mg ZP3+5 mL三蒸水配成0.4 mg·mL-1的溶液与费氏完全佐剂按1∶1比例配成的免疫试剂（0.15 mL）对小鼠双脚后掌进行皮下多点注射，2周后将用2 mg ZP3+5 mL三蒸水配成0.4 mg·mL-1的溶液与弗氏不完全佐剂按1∶1比例配制成免疫强化试剂（0.15 mL）进行腹腔注射，5周后同法再次加强免疫。在免疫后的第35天，模型组小鼠出现易激惹、大便干结，动情周期紊乱，在第4周、第8周时卵巢生长卵泡比率降低、应用免疫组化、Western Blot检测的GDF-9、Smad2蛋白表达明显下降。王佩娟等[20]将由弗氏不完全佐剂（美国Sigma公司）配成含有5 mg·mL-1结核杆菌H37Ra（美国BD Difco公司）的完全弗氏佐剂和用ZP3330-342氨基酸系列的多肽片段配制成1 mmol·mL-1的溶液按等比例混合配成免疫乳化剂，在第0天和第14天分别用0.1 mL乳化剂皮下注射B6AF1小鼠的脚掌和尾根。进行免疫后小鼠精神状态明显烦躁易怒、精神萎靡不振、反应迟钝、行动迟缓，脾脏指数升高，胸腺、卵巢、子宫指数均下降。上述两种造模虽不太一样，但其大体方向一致，都可建立免疫性动物模型，该技术目前在国内较为成熟，但所需成本相对较高，并且在溶液配置过程中需要精准无误。

1.3.2 胸腺切除 胸腺属于中枢免疫器官，主要参与T细胞的分化和发育，切除易感品系新生期第2～5天小鼠的胸腺可发生类似人类自身免疫性卵巢疾病的典型卵巢病理学改变。涂晓娟等[21]摘除出生3 d以内雌性小鼠的胸腺，术后5周血清FSH、LH升高，伴E2下降，卵巢组织中出现较明显的炎细胞浸润及卵泡闭锁，并且从术后5周开始，血清中炎性细胞因子转化生长因子-β1（TGFβ1）和白细胞介素-4（IL-4）降低，而干扰素-γ（IFN-γ）和白细胞介素-21（IL-21）升高，显示造模成功。该方法对于切除胸腺及缝合的技术要求较高，难度大，所致动物病死率高，目前尚难推行。

1.4 代谢性POF造模法

Guerreero等[22]研究发现，半乳糖及其代谢产物过多堆积可导致育龄期女性原发或继发性闭经、不孕及POF。包秀芳[23]连续给9～12周龄的大鼠喂35%半乳糖食物（模型组）和25%的标准食物（对照组），80 d后发现模型组的大鼠体内半乳糖含量较对照组增加，并出现卵巢萎缩、重量减轻，卵巢组织中卵泡发育受阻。何连利[24]通过给小鼠颈背部皮下注射D-半乳糖200 mg·（kg·d）-1，6周后发现小鼠精神萎靡，饮食减少，体毛晦暗无光泽，卵巢系数降低，单位卵巢面积内卵泡数、黄体数减少，闭锁卵泡数增多，FSH升高，E2及抗缪勒管激素值（AMH）降低。这两种方法均表明通过增加动物体内半乳糖的含量，导致代谢物出现蓄积，进而导致机体代谢出现较为严重的紊乱可以建立POF的动物模型。该方法操作简便，无须特殊仪器，目前临床应用也较为广泛。

1.5 过度瘦身POF造模法

高洒洒等[25]、王艳平等[26]给予模型组大鼠每日左旋肉碱灌胃600 mg·kg-1、跑台运动（跑台坡度为0°，跑速为28 m·min-1，20 min·d-1，运动6 d，休息1 d）、50%日常摄食量，且灌胃在运动前30 min进行。造模过程中发现干预4周和干预8周的大鼠体质量均下降，且干预8周的大鼠体质量下降更为明显，较原始值下降了23%，较空白组下降了35%，而干预4周的大鼠体质量较原始值下降了17%，较空白组下降了26%。给予恢复饮食后，造模4周的大鼠体质量恢复至空白组的98%；造模8周的大鼠体质量恢复为空白组的83%。模型组大鼠除体质量下降外，还有精神不振，活动减少，反应迟钝，烦躁不安，拱背易惊，体毛粗糙无光泽，对疼痛敏感，动情周期紊乱，血清学检测发生改变，表示造模成功。这是近年来新出现的一种造模方法，成本经济、耗时也短。

1.6 基因敲除POF造模法

基因敲除是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的分子生物学技术。目前研究较多的就是敲除PTEN和FOXL2基因。PTEN基因是通过影响脂质磷酸酶的活性，抑制PI3K-Aktm TOR通路，从而调控细胞增殖、存活和能量代谢[27]，Reddy[28]发现，小鼠去除PTEN基因2 d时无明显原始卵泡，同时，FSH和LH明显升高，对照组则仍有62.9%的卵泡为原始卵泡；Pisarska等[29]研究FOXL2基因在鼠卵巢中卵泡发育和成熟阶段的表达，提出野生型FOXL2的显性负突变可能会增加中、小卵泡中StAR和其他卵泡分化基因的表达，从而加速卵泡发育，导致休眠卵泡的初始募集增加出现POF表型。Uda等[30]通过发现小鼠体内FOXL2基因被破坏后，小鼠颗粒细胞停止发育，卵母细胞逐渐闭锁，8周时原始卵泡池耗竭，16周时卵巢无正常的卵母细胞和卵泡，致使小鼠不孕，表明了FOXL2基因与卵泡的发育有关。本方法有助于我们了解某特定基因对于POF的作用，但一种模型仅能研究一两个基因的作用，而POF的发生并非几种基因改变所致，对于其病因学的研究有所限制，并且操作起来难度大、成本高。

1.7 应激型POF造模法

应激是指机体在遇到各种不利的刺激后，会通过调节神经-内分泌系统而产生一系列反应，会扰乱生理或心理状态。现代社会中女性正承担着越来越多的责任及压力，机体常处于应激状态，常出现月经失调、闭经、不孕等疾病。阿卜力孜·克热木等[31]通过给予大鼠湿寒和强光环境，即温度为（7±1）℃、湿度为（85±5）%，每日晚8点至早8点持续同等强度光照（40W日光灯直射，距离2.5 m），早8点至晚8点放置黑暗环境，避免一切光照，连续20周后，观察到大鼠血E2、β-EP水平降低FSH、LH的水平显著升高，卵巢组织中未见明显的初级、次级卵泡，偶见原始卵泡，囊状闭锁卵泡增多，空泡样变化多，说明卵巢水肿严重，间质腺增生且伴有纤维化，得出持续慢性应激可诱发POF。该方法经济易行，容易操作，但造模周期相对较长，需要对大鼠生活的环境严格调控，也是近年来比较热的一种造模方法。

综上所述，各类造模方法各有特点，本文通过查阅近10年文献发现目前应用最为广泛的是CTX、雷公藤多甙及注射ZP3建立的POF模型，其中CTX和雷公藤多甙两种模型建立时更经济便捷，且用时短，建立的模型更稳定。应激和过度瘦身造模是近年来新出现的方法，操作简单，更切合临床中当今广大女性的生活方式。而基因敲除、胸腺切除的造模方法在操作过程中难度极大，对于实验室条件要求也高，目前采用的较少。总之，建立理想的动物模型有诸多困难，研究者在具体实验研究时根据实验目的和实验条件选择合适的模型则非常重要，期待日后有更多对于POF的病因、病机及治疗的完善的研究。