基于补体机制的肺癌研究进展

何培勇 李竹 刘建英

肺癌(LC)是全世界最常见的恶性肿瘤，占所有癌症比例的11.6%，同时是癌症相关死亡的主要原因，占所有癌症相关死亡的18.4%[1]。尽管针对LC的放化疗、靶基因治疗及免疫治疗已经取得了很大进步，但LC的总体生存率仍未显著提高，从而强调了对新型治疗方法的需求，靶向补体代表一种新型免疫疗法。

补体系统的激活

补体系统是由超过30个细胞内外及膜结合的蛋白组成，占人血清蛋白的5%到10%，主要在肝脏合成释放，目前研究支持补体系统可在血管内、组织细胞和局部浸润细胞的细胞内合成并分泌[2]。主要由经典途径、凝集素途径和替代途径三种基本途径激活。C3和C5是补体途径的中心分子，不同途径的激活在C3转化酶形成中会聚，C3转换为C3a和C3b，C3b与C3转换酶结合进一步裂解C5为C5a和C5b，随后组装成攻膜复合物(MAC)介导靶细胞裂解。补体分子不是简单的蛋白分子，复杂的补体系统具有识别并呈递抗原、连接先天免疫与适应性免疫、趋化巨噬细胞等炎症细胞在炎症部位聚集、免疫监视和免疫平衡等复杂的免疫功能[3]。同时在凝血、血管生成、神经发育、组织修复、骨代谢、胰岛素分泌等非免疫反应中发挥重要作用[4]。既往认为，补体系统能够起到监视肿瘤的作用，补体激活形成攻膜复合物和补体5b-9复合物(C5b-9)能导致肿瘤细胞的膜破坏。然而，最近研究发现即使C5b-9沉积在A549肺癌组织中，癌细胞也会继续增殖生长[5]。近10年的研究支持以C3a和C5a为中心的补体分子的激活，具有促进肿瘤生长和转移的功能，同时基于补体分子的癌症免疫疗法，更加说明补体发挥着促进肿瘤进展的作用。

补体诱导肺癌免疫抑制微环境

肿瘤微环境(TME)在肿瘤发生、发展、复发及转移中具有不可替代的作用，由肿瘤细胞、基质外细胞(免疫细胞和成纤维细胞)和细胞外成分组成。肿瘤细胞及基质外细胞产生补体蛋白，在TME中被激活，激活的补体蛋白可沉积在细胞表面或释放到体液中与特定的受体结合，募集免疫抑制淋巴细胞群，包括肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、髓源抑制细胞(MDSCs)和调节性T细胞(Tregs)进入TME，营造免疫抑制微环境，促进肿瘤细胞的增殖和迁移[6]。肿瘤相关巨噬细胞(TAM)是浸润在肿瘤组织中的巨噬细胞，是肿瘤微环境的重要组成部分，主要通过阻断CD8+T淋巴细胞作用促进肿瘤进展[7]。MDSC是一组从不成熟髓系细胞衍生的高度异质细胞，通常分为两个亚群组，多形核的MDSC(PMN-MDSC)和单核细胞的MDSC(M-MDSC)，MDSC涉及肿瘤血管形成、肿瘤细胞侵袭、转移前生态位的形成，外周血MDSCs的水平与LC患者的预后密切相关，同时研究支持MDSC可用于预测免疫检查点封锁治疗的的疗效，但仍有许多未知的机制需要进一步研究[8]。调节性T细胞则是一类控制体内自身免疫反应的T细胞亚群，由CD4+T淋巴细胞分化而成，Treg被肿瘤细胞和其他基质细胞募集到TME中，促进肿瘤进展[9]。

C5a在非小细胞肺癌(NSCLC)局部表达增加，参与肺癌微环境的形成，肺癌患者血浆C5a水平升高，则提示存在肿瘤微环境外的全身补体激活[10]。肿瘤细胞衍生的C5a可诱导MDSC的招募和分化，促进Treg和TAM的形成，抑制T淋巴细胞的免疫反应，抑制免疫系统对肿瘤细胞的攻击[11]。肺癌细胞可自分泌C3a和C5a，作用于CD8+T细胞表面受体，促进IL-10的释放，抑制CD8+T细胞的功能，营造免疫抑制微环境[12]。靶向C5aR显著降低了荷瘤小鼠肺癌组织内的MDSCs聚集，说明C5a/C5aR的拮抗效应主要体现在MDSCs群体上[13]。有研究表明，C5a可结合TAM表面的C5aR，通过NF-κB途径介导巨噬细胞极化，促进结肠癌转移[14]。在卵巢肿瘤小鼠模型中，表达C5a的肿瘤细胞表现出加速生长，并且在脾脏和肿瘤组织中观察到明显降低的CD4+和CD8+T淋巴细胞浸润[15]。NSCLC患者肺癌组织中与增殖相关的基因(KLF5、GCN5、GDF15)以及C5a和C5aR的表达明显上调，C5a可以通过增加这些增殖基因的表达来促进A549细胞增殖[16]。肺癌小鼠模型血浆C3a的表达水平更高，C3缺陷型小鼠可以显著抑制小鼠肺癌细胞的生长，生长抑制效应伴随着肿瘤局部CD4+T细胞的聚集和肺癌细胞表面MHC Ⅱ类分子的高表达[17]，而肺癌细胞内源性MHC Ⅱ分子的高表达可以增强PD-1/PD-L1检查点的封锁效应，这与局部T细胞的浸润增加有关，提示这些途径的联合阻断可能加强检查点疗法的抗肿瘤反应[18]。在NSCLC患者癌组织中证实C3在鳞癌和腺癌的细胞质以及基质和癌周巢中强烈表达，C3高表达与CD4+和CD8+T细胞的高度浸润呈正相关[19]。以上研究支持以C3a和C5a为主的补体蛋白参与肺癌微环境的形成，同时伴随着肿瘤外的全身补体激活。

补体参与肺癌的转移

癌症转移是指原发型肿瘤细胞迁移到远处部位，并重新定位的过程。补体可以通过上皮-间质转换(EMT)、转移前生态位的形成、增加血管对肿瘤细胞的通透性等机制促进肿瘤转移。最近研究报道了肿瘤细胞分泌的C5a和C3a可分别诱导肝细胞癌和卵巢癌的EMT过程，通过下调E-钙粘蛋白的表达增强肿瘤细胞的侵袭性[20]。肺癌组织中C5aR与E-钙粘蛋白的表达呈负相关，C5aR阻断会损害肺癌细胞的迁移并上调E-钙粘蛋白的表达，拮抗C5aR1可抑制肺癌的EMT和侵袭性[21]，抑制补体途径的治疗策略可能是抑制EMT和限制肺癌远处转移的一种有前途的方法。C5a-C5aR信号转导通过促进Treg生成并抑制T细胞应答来促进乳腺癌肺转移[22]。结肠癌细胞产生的C5a通过增加单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)，IL-10，Arg-1和TGF-β1的表达促进肿瘤转移[23]。C3在肺癌转移模型中上调，对于软脑膜空间内的癌细胞生长是必需的，肺癌细胞衍生的C3a激活脉络丛上皮中的C3a受体，破坏血液CSF屏障，有利于肺癌脑转移[24]。CAF是TME中丰富且重要的基质细胞，癌相关成纤维细胞(CAF)是乳腺癌肿瘤微环境(TME)主要聚集细胞之一，C3a-C3aR通过激活PI3K-AKI信号通路增强CAF分泌转移细胞因子(如TGF-β)，从而促进乳腺癌的肺转移，药理学阻断C3aR可有效的抑制小鼠模型中乳腺癌的肺转移[25]。肺泡巨噬细胞(AM)可在C5a的作用下局部增殖，获得T细胞抑制功能，有助于乳腺癌肺转移前生态位的形成，C5aR抑制可协同预防乳腺癌肺转移，成为抗癌治疗的新靶点[26]。阻断C5aR1信号的传导消除了与肿瘤转移相关的破骨细胞的生成活性，损害了骨质的定植，有效的抑制了肺癌骨转移，表明靶向C5a在抑制肺癌骨转移的潜在疗效，并且发现该作用在体外可通过添加外源性趋化因子CXCL16来减轻[27]。CXCR6是一种存在于肺癌细胞中的受体，CXCL16/CXCR6轴的激活可上调肺癌细胞分泌基质金属蛋白酶(MMP)，增加肿瘤的侵袭性和迁移力[28]。一种新型小分子C5aR抑制剂DF3016A可以抵抗多种肿瘤的骨转移，它可以降低破骨细胞的成骨活性，并可通过减少归巢于骨的肿瘤细胞水平来抑制肿瘤骨转移[29]。综上，补体在原位肿瘤或转移靶器官乃至全身激活，将有助于肿瘤细胞的转移定植，靶向补体为抑制肺癌转移带来新的希望。

补体分子作为肺癌的新型标志物

目前临床上的肺癌标志物的特异性和敏感性在肺癌早期乃至晚期诊断效果均不佳，超过75%的肺癌患者在III期和IV期诊断，迫切需要更有价值的早期标志物协助早期肺癌的诊断。生物标记物如自身抗体、microRNA、补体片段等新型标志物已经在肺癌临床队列的血液标本中产生了有希望的结果。在肿瘤致瘤性转化过程中，不同组织学亚型的肿瘤细胞可激活补体系统，生物体液及组织中补体衍生分子的检测可以为肿瘤的诊断和预后提供信息，目前已经提出过敏毒素作为潜在的新型标志物协助肿瘤的临床管理[10]。C4d作为一种稳定的补体裂解产物，在来自肺癌患者的肺癌组织、肺泡灌洗液和血浆中均增加，C4d在肺癌早期诊断和晚期预后评估中均有价值, 并且因为C4d在肺癌患者血浆中显著升高而在COPD患者中却没有，提示可能避免与C5a测量相关炎症的混杂效应[30]。而最近使用对C4d的特异性抗体，已经显示能够通过ELISA评估肺癌患者中C4d的血浆水平来区分良性结节和恶性结节[31]。晚期肺癌患者血浆中C5a显著高于对照组[10]，C3a在食管癌和乳腺癌中表现出了预后价值[32]，最新一项meta分析表明，肺癌患者血清C3浓度显著高于健康人。但需注意，这些标志物在肺癌诊断中缺乏特异性，肺部感染及炎症是最重要的混杂因素，或许会干扰补体分子作为肺癌独立标志物的效用。

靶向补体途径作为肺癌新型免疫疗法

抗癌的免疫疗法旨在重新激活抗肿瘤免疫周期，包括免疫原性细胞死亡、抗原呈递细胞的成熟、T细胞的激活、阻断免疫抑制剂等。癌细胞表达异常水平的细胞蛋白或突变蛋白，适应性免疫系统可以初步识别肿瘤细胞，后期主要依靠T细胞激活查杀，补体分子的激活参与了T细胞的免疫抑制，表明靶向该途径可能代表一种新型的免疫疗法[17]。用免疫检查点抑制剂破坏程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)途径代表了非小细胞肺癌治疗的重大突破，活化的T细胞表面PD-1升高，与在癌细胞以及包括巨噬细胞在内的肿瘤微环境中的炎症细胞中表达升高的PD-L1结合，导致T细胞凋亡、无反应和衰竭，从而保护肿瘤细胞免于CD8+T细胞介导的细胞溶解作用[33]。PD-1和PD-L1的单克隆抗体在肺癌治疗中显示出临床疗效，靶向免疫检查点程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或其配体(PD-L1)的中和抗体旨在重新激活T淋巴细胞，并且抗体产生持久的应答，不引起严重的副反应。然而，相当一部分患者对这些疗法表现出先天性和后天性的的抵抗力，单独抑制该免疫检查点的总体有效率不足20%，有报道在肺腺癌络氨酸激酶突变基因靶向疗法无效的情况下，单独靶向PD-1/PD-L1未显示出疗效[34]。在这种情况下，靶向多于一个癌症免疫周期步骤的联合疗法可能会产生重大益处。研究表明，PD-1/PD-L1抗体诱导C5a产生，在两条途径之间建立了调节环[35]。适体是短的单链寡核苷酸，其能够特异性结合单分子和细胞结构，在肺癌小鼠模型中，使用针对C5a的适体(AON-D21)和抗PD-1单克隆抗体，对治疗肺癌的肿瘤负荷和转移有显著的协同作用，这种效应伴随着肿瘤内MDScs的减少和CD8+T细胞频率的增加，以及CD8+T淋巴细胞衰竭标志物的减少，导致CD8+T细胞耗竭的逆转，并延长了小鼠生存期[36]。NOX-D12是一种L-RNA适体，NOX-D12和抗PD-1单克隆抗体的联合疗法抑制了C5a和C5aR1介导的CXCL16的高表达，从而抑制了肺癌小鼠的骨转移[37]。补体C3是补体激活的核心分子，是补体抑制特别有吸引力的靶标，C3片段对垂死细胞进行调理作用可诱导抗炎细胞因子的产生，并降低树突状细胞成熟所需的共刺激分子，导致肿瘤对T细胞免疫耐受，将肿瘤转化为易受PD-1/PD-L1封锁的肿瘤，二者联合靶向，对抑制肿瘤生长可能存在协同作用[7]。C3a可通过C3a-C3aR-P13Kγ信号传导调节TAM抑制抗肿瘤免疫，具有高表达的肿瘤细胞中C3的缺失可增强靶向PD-L1的抗肿瘤疗效[38]。C3a-C3aR信号传导通过抑制中性粒细胞和CD4+T细胞应答而促进黑色素瘤的生长，拮抗C3aR对黑色素瘤、肠癌、乳腺癌均具有抑制作用，是抗肿瘤反应的有效手段[39]。靶向血管内皮生长因子(VEGF)的治疗抗体已经成为肿瘤治疗的关键，但单一疗效通常受到耐药和多种血管生成机制的限制，基于补体促进癌症进展和血管生成中的作用，正在成为癌症靶向治疗的候选者，靶向补体C3b/C4b与阻断VEGF对抑制乳腺癌、结肠癌血管形成、细胞增殖和MDSC浸润具有协同作用[40]。以上证据支持补体阻断与癌症-免疫周期有关的许多效应子途径的观点，为旨在增强抗PD-1 / PD-L1检查点抑制剂的抗肿瘤功效的新治疗组合提供理论基础。

结 语

最新有关补体产生及其生物效应的观点，正在挑战传统的认识，特别是在促进肿瘤进展中所发挥的作用。补体中心分子C3a和C5a已被确定为免疫检查点阻断剂的潜在组合伙伴，补体途径作为肺癌的治疗和预防策略，具有重大意义。在本综述我们强调了补体抑制的抗肺肿瘤价值，但是，还需要对补体途径在肿瘤微环境中的作用有透彻的了解，才能有选择性的、安全的靶向补体的促肿瘤效应。