生物标志物在特发性肺纤维化中的研究进展

沈怡 李雅倩 胡晓燕 严辰希 陈学远

2.310015 浙江 杭州，杭州师范大学医学院

特发性肺纤维化(Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一种发病机制不明，慢性进行性的纤维化肺部疾病，临床表现为进行性加重的呼吸困难、持续性干咳、限制性通气功能障碍，最后因呼吸衰竭而死亡。近年来，随着对IPF发病机制研究的深入，越来越多的细胞因子被发现与IPF有关联，已有提议将研究较为透彻的细胞因子作为IPF的生物标志物，在评估疾病早期诊断、进展、预后方面具有一定的意义[1]。但仍有新近发现的细胞因子值得进一步探索作为IPF潜在生物标志物的价值。

生物标志物

生物标志物是指可以标记系统、器官、组织及细胞结构或功能改变或可能发生改变的生化指标。生物标志物已成为研究IPF的热点之一，不断有新的细胞因子被证实参与IPF，被认为是IPF潜在的生物标志物。近年来已从IPF患者的血液、支气管肺泡灌洗液、肺组织等中检测到多种生物标志物，特别是从血液中获取的生物标志物因为其创伤性小，获取方便，可连续监测等优点对应用于临床有较大的前景。

IPF的生物标志物

一、MUC5B

黏蛋白5B(Mucin-5 subtype B，MUC5B)是一种由呼吸道浅表上皮细胞和黏膜下黏液腺细胞产生的分泌型粘蛋白，主要是在呼吸道远端产生，其主要作用是黏液屏障保护，气道黏液纤毛清除和气道抗炎宿主防御[2]。研究发现MUC5B启动子区域中rs35705950 G>T的单核苷酸多态性是IPF最强的遗传危险因素，使远端气道过度表达MUC5B，大量MUC5B蛋白沉积在微小蜂窝囊肿中[3]。Evans等[2]推测MUC5B过表达可能会使气道中黏膜纤毛清除功能、宿主防御能力降低，导致空气中的颗粒物质的滞留引起肺损伤产生疤痕组织，持续的纤维增生引起肺纤维化。有研究表明，GG基因型的IPF患者在随访期间，能反映疾病预后的用力肺活量(Forced vital capacity，FVC)、一氧化碳弥散量(Carbon monoxide diffusing capacity，DLCO)和肺总量(Total lung capacity，TLC)变化程度较GT基因型大，死亡率也是GG基因型明显高于GT基因型(χ2=29.069，P=0.02)[4]。MUC5B对肺功能的影响可预测IPF预后。

二、KL-6

Ⅱ型肺泡细胞表面抗原 (Krebs von den Lungen 6，KL-6)顾名思义是由Ⅱ型肺泡上皮细胞分泌的一种大分子糖蛋白，KL-6也可由细支气管上皮细胞分泌，能促进成纤维细胞迁移、增殖，并抑制成纤维细胞的凋亡。KL-6被发现在IPF、结缔组织相关性间质性肺炎、过敏性肺炎、肺泡蛋白沉积症等间质性肺病中高表达[5]。有研究证实IPF、非特异性间质性肺炎(Non-specific interstitial pneumonia，NSIP)支气管肺泡灌洗液中的KL-6水平明显高于健康对照组，两组病例组KL-6水平均与疾病严重程度相关，但IPF与NSIP两组的KL-6水平无显著差异[6]。因此，KL-6不能将IPF与其他间质性肺炎鉴别，作为IPF的诊断性生物学指标存在争议，但KL-6被认为是评估IPF疾病活动进展的重要标志物。最近一项研究纳入20例IPF患者，进行为期1年的观察，研究发现FVC<50%组的KL-6水平比FVC>50%组显著增加；进展期患者KL-6水平较非进展期患者显著升高[7]。

三、MMP-7

基质金属蛋白酶-7(Matrix metalloproteinase 7，MMP-7)主要在肺泡巨噬细胞以及肺组织的上皮细胞中表达，可降解细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)的多种成分。目前研究提示MMP-7可作为潜在的IPF诊断生物标志物，MMP-7在IPF患者的肺组织、血清、支气管肺泡灌洗液中表达均较健康对照组显著升高，并且当血清MMP-7水平大于1.75 ng/mL时，可将IPF与NSIP、隐原性机化性肺炎、脱屑性间质性肺炎、呼吸细支气管炎伴间质性肺炎相区分[8]。不仅如此，有研究证明MMP-7水平还可预测疾病的进展，患者血清MMP-7<3.8 ng/mL的病情恶化时间与MMP-7≥3.8 ng/mL有显著差异，阈值水平高的患者病情进展的风险要高2.3倍[9]。

四、CCL18

趋化因子配体18(CC chemokine ligand 18，CCL18) 是来源于M2型肺泡巨噬细胞的趋化因子，能促进肺成纤维细胞产生胶原，研究发现特发性肺纤维化急性加重期收集的支气管肺泡灌洗液中CCL18含量较稳定期的IPF增加，并且在特发性肺纤维化急性加重期期间，连续监测支气管肺泡灌洗液中CCL18水平，发现是呈升高趋势，加上CCL18的水平与肺功能呈显著负相关，可在一定程度上评估病情，判断预后[10-11]。在一项纳入72名IPF患者的前瞻性研究中结合多因素统计分析揭示，CCL18是可以预测IPF患者死亡率的生物标志物：通过受试者工作特征曲线(Receiver operator characteristic curve，ROC曲线)分析，将CCL18临界值定义为150ng/mL(灵敏度0.83；特异性0.77)，当调整年龄、吸烟史、性别等数据后，血清CCL18水平>150ng/mL的患者与死亡风险增加相关[12]。

IPF的潜在生物标志物

一、PD-1、PD-L1

程序性死亡分子-1(Programmed death-1，PD-1)和程序性死亡分子配体-1(Programmed cell death1 ligand 1，PD-L1)皆为 B7 家族成员，PD-1表达在以T细胞为主的活化的淋巴细胞中，PD-L1是PD-1的主要配体，二者相结合可显著使T细胞的新陈代谢减缓、细胞因子分泌减少，同时也使T细胞本身增殖、分化被抑制。众所周知，PD-1在肿瘤浸润的淋巴细胞上高表达，而PD-L1也在肿瘤细胞的表面上调[13]。考虑到IPF与肺癌存在重叠的病理过程，国外学者逐步研究免疫检查点PD-1和PD-L1在IPF中的作用，Celada等[14]发现IPF患者T细胞上PD-1表达明显高于健康对照组，在动物实验及细胞学实验中证实PD-1是促进肺纤维化的重要细胞因子，通过刺激STAT3信号通路上调促纤维化因子转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)和白介素17A(Interleukin-17A，IL-17A)，促进胶原蛋白沉积。Jovanovic等[15]进一步的研究发现PD-L1在IPF患者肺活检组织的肺泡巨噬细胞上过表达，过表达PD-L1的巨噬细胞释放促纤维化因子参与肺纤维化过程；并且血清PD-L1水平在IPF组为(117.7～483.1)ng/L，健康对照组为(52.4～119.7)ng/L，两组差异有统计学意义。PD-1、PD-L1均参与肺纤维化的过程，但仍需大样本前瞻性的研究证实PD-1、PD-L1作为IPF生物标志物的价值。

二、CD248

CD248又称为内皮唾液酸蛋白或肿瘤内皮标志物1(Tumor endothelial marker 1，TEM-1)，是由基质细胞产生表达的一种跨膜糖蛋白。最初的研究认为CD248在肿瘤组织中过表达，但随着研究的进展，CD248被发现在肝、肾、肺纤维化中表达升高[16]。有研究对22位IPF患者进行肺组织活检，免疫组织化学分析显示，肺组织纤维化区域的成纤维细胞样基质细胞上CD248染色呈阳性，并且用数字图像处理发现，CD248染色面积与肺功能参数和肺纤维化程度呈显著负相关[17]。因此CD248对判断IPF疾病的预后有一定的价值。该研究进一步对比了正常来源和IPF来源的成纤维细胞CD248的表达，证实IPF来源的肺成纤维细胞中CD248蛋白水平显著高于正常肺成纤维细胞[17]。

三、A2b腺苷受体

腺苷是一种内源性核苷，通过结合细胞膜上的特定受体，发挥多种生理和病理调节作用，目前有4种腺苷受体，其中A2b腺苷受体是一种典型的G蛋白偶联受体，分布在广泛的组织和细胞中。A2b腺苷受体的激活可导致慢性肺部疾病，包括纤维化[18-19]。有研究发现，IPF患者肺组织中A2b腺苷受体无论在基因还是蛋白层面表达均较正常对照组明显增加[19]。动物实验发现，肺纤维化小鼠A2b腺苷受体的mRNA表达显著增加，在用选择性A2b腺苷受体抑制剂CVT-6883治疗肺纤维化小鼠后，TGF-β1和ECM表达水平下降，A2b腺苷受体可能是通过激活TGF-β1/SMAD3信号通路促进肺纤维化产生[20]。A2b腺苷受体作为IPF的生物标志物存在不充分性，仍需大样本重复的临床研究来验证。

四、YKL-40

YKL-40又称几丁质酶3样蛋白1，属于几丁质酶家族的一种糖蛋白，可由巨噬细胞、中性粒细胞等正常细胞产生，也可在一些恶性肿瘤细胞中表达，YKL-40能促进细胞的黏附、迁移、增殖和分化。有研究证实YKL-40的含量在IPF患者血清和支气管肺泡灌洗液中明显高于正常对照组，免疫组织化学技术也显示在正常对照组的肺组织中几乎没有YKL-40表达，但在IPF患者肺组织纤维化病变区域YKL-40有表达，特别是在纤维化病变附近的肺泡巨噬细胞中表达更明显[21]。Korthagen等[22]发现，IPF患者表达YKL-40水平与CHI3L1-329基因型相关，不论在血清还是支气管肺泡灌洗液中，GG基因型的YKL-40水平较AG基因型升高明显，同时发现YKL-40水平提示疾病预后，IPF患者血清和支气管肺泡灌洗液中YKL-40的含量分别低于各自的临界值79 ng/mL、17 ng/mL时的生存率要比高于临界值的患者生存率要高。

五、CCN1

细胞基质蛋白CCN1又称富半胱氨酸61(Cysteine-rich 61， Cyr61)是一种分泌型蛋白质，参与血管生成、炎症、损伤修复等过程。早在几年前，就对CCN1与肺部相关疾病进行研究，有不少的研究报道CCN1是急性肺损伤的生物学标记物；并与慢性阻塞性肺疾病、哮喘、肺癌等疾病相关，也被认为是这些慢性肺部疾病的潜在生物标志物[23]。CCN1被发现在IPF肺组织的活动性纤维化区域高表达，研究证明CCN1通过TGF-β1/ SMAD3信号传导通路促进肺纤维化[24]。高水平CCN1(≥0.147 ng/mL)IPF组中位生存时间为3.3年，低水平CCN1(<0.147 ng/mL)IPF组为5.7年，两者差异有统计学意义，且高水平CCN1 IPF组发生肺移植或死亡的风险是低水平CCN1组的近2倍[25]。尽管如此，但仍需进行更大规模的前瞻性研究来支持CCN1水平可能具有作为IPF预后生物标志物的潜力。

六、抗凝血酶Ⅲ

抗凝血酶Ⅲ (Antithrombin Ⅲ，AT-Ⅲ)是丝氨酸蛋白酶抑制物超家族中的抗凝因子，主要由肝脏产生，释放到血浆中的重要抗凝物质。Meta分析提出IPF患者发生静脉血栓的风险，是一般人群的2倍[26]。有研究使用同位素标记相对和绝对定量(Isobaric tag for relative and absolute quantitation，iTRAQ)和质谱多重反应监测(Multiple reaction monitoring，MRM)这两种定量蛋白质组学技术发现IPF患者AT-Ⅲ表达下调[27]。相反，Bergantini等[28]用酶联免疫吸附试验测定IPF组与健康对照组血清中AT-Ⅲ水平，IPF患者血清中AT-Ⅲ明显升高，通过ROC曲线分析，定义AT-Ⅲ水平126.5 μg/mL为临界值，将IPF患者分为2组，2组间IPF生存率差异有显著统计学意义(P=0.006 6)，并且AT-Ⅲ预测IPF生存率有较高的敏感性与特异性(曲线下面积0.93、敏感性1.00、特异性0.80)。以上两种检测手段虽对AT-Ⅲ的结果有些争议，但无论哪种检测方法，IPF与AT-Ⅲ都有相关性，Bergantini等还证实AT-Ⅲ的水平与FVC、第一秒用力呼气容积(Forced expiratory volume in one second，FEV1)呈显著负相关[28]。由此看来，AT-Ⅲ有可作为评价IPF预后指标的价值。

七、Galectin-1

半乳糖凝集素-1(Galectin-1，Gal-1)是β-半乳糖苷凝集素家族的成员之一，不仅在人体正常组织中表达，而且也在多种肿瘤组织中高表达，参与肿瘤发生、肿瘤血管新生、肿瘤细胞黏附、肿瘤免疫逃逸[29]。有研究分析了来自肺组织研究协会提供的160名IPF患者和108名健康对照者的肺样本的微阵列数据集(GEO登录号：GSE47460)，发现IPF患者肺部的Galectin-1水平上调，Galectin-1作为低氧反应蛋白，在肺组织发生纤维化的低氧环境中表达增加，并激活TGF-β1/ SMAD3、ITGB1 / FAK1、Wnt信号通路促进肺上皮细胞增殖，使其在成纤维细胞灶周围增生[30]。另一项研究测定了IPF、结节病、系统性硬化病相关的间质性肺疾病和健康对照组支气管肺泡灌洗液中Galectin-1的水平，发现IPF患者的Galectin-1水平与其他三个对照组相比有显著差异，Galectin-1在IPF中表达更高，但结节病、系统性硬化病相关肺间质和健康对照组之间Galectin-1水平没有明显差异，Galectin-1可将IPF与非IPF相鉴别，并且在IPF患者中，Galectin-1与肺一氧化碳弥散量百分率(DLCO%)和肺一氧化碳转移系数百分率(KCO%)呈显著负相关[31]，提示Galectin-1可能与IPF疾病进展相关。近几年Galectin-1在IPF中的研究成果，使得Galectin-1作为IPF生物标志物崭露头角。

八、LTBP2

转化生长因子结合蛋白2(Laten transforming growth factor binding protein 2，LTBP2)是四种LTBPs亚型之一，能调节肺纤维化的关键细胞因子TGF-β的激活[32]。Enomoto等[33]发现在IPF患者活检肺组织中无论是应用免疫组织化学技术还是免疫荧光技术，纤维化间质中LTBP2染色都呈阳性，而正常肺组织阳性反应很少；同时检测血清中LTBP2水平，IPF患者要显著高于健康对照，急性加重期要显著高于非急性加重期。有国内学者进一步研究LTBP2水平与IPF预后的关系，将120例IPF患者按预后效果分为预后良好组和预后不良组进行统计学分析，发现LTBP2水平在预后不良组显著高于预后良好组，并计算出预测患者预后不良的诊断界值为12.25 ng/mL[34]。

九、LOXL2

赖氨酰氧化酶相关蛋白2 (Lysyl oxidase-like 2，LOXL2) 与胶原蛋白重塑密切相关，可促进纤维胶原的交联和成纤维细胞增殖，在纤维化中起关键作用。两个独立的IPF队列均显示血清LOXL2水平与临床指标FVC和DLCO无统计学差异，但均与肺移植、因呼吸道疾病住院、死亡等疾病进展相关，无论在哪个队列中，LOXL2的水平越高，发生疾病进展的可能性越大[35]。Aumiller等[36]对比5名健康对照和14名IPF患者肺组织切片，Masson染色显示支气管上皮细胞和肺间质中LOXL2的表达在IPF组明显高于健康对照组，同样，小鼠肺纤维化模型中LOXL2在肺上皮细胞与间质区域表达升高。LOXL2通过TGF-β诱导成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，构建重塑ECM，使得ECM过度沉积，加上不论是在血清中还是肺组织中，LOXL2都在IPF中表达增加，证明LOXL2在肺纤维化中发挥着举足轻重的作用，可作为一项预测IPF疾病进展的生物标志物。

存在的问题与展望

随着近年来对IPF研究的逐渐深入，IPF相关的生物标志物研究已取得不少进展。除了上述的生物标志物，还有骨膜蛋白、端粒、热休克蛋白47等都被作为IPF的生物标志物在研究。像CD248、A2b腺苷受体、CCN1 、Galectin-1等标志物在IPF的相关研究中尚少，并且研究存在局限性，很多研究都来自观察单个队列，病例组的数量相对少，缺乏前瞻性。总之，仍然需要更进一步的研究去探索IPF的生物学标志物，需要更多的大样本前瞻性研究的实施去证实生物标志物与IPF的相关性，能为应用于临床做好充足的准备。