长治地区结核分枝杆菌耐药基因突变位点分析

宋凌燕，王亚飞，王敏，薄红霞，郭旭霞

(长治医学院附属和平医院，山西 长治 046000)

结核病目前仍是危害人类健康的重大传染病，耐多药结核病(MDR-TB)的出现和流行是目前全球结核病控制的重大挑战。据世界卫生组织(WHO)2018年发布的数据[1]，中国结核病患病率占全球的9%，因此加强结核分枝杆菌耐药性的研究尤其重要。耐药基因检测可以快速、准确获得患者的分子药敏试验结果，有利于早期治疗。目前，利福平和异烟肼作为抗结核的一线药物，具有杀菌力强、不良反应少、价格便宜等优点，本研究通过熔解曲线法分析长治地区结核分枝杆菌对利福平和异烟肼这两种药物的耐药率及耐药基因突变位点，以期给利福平和异烟肼抗结核病的临床应用研究提供客观依据。报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2018年2月—2019年8月住院患者结核分枝杆菌涂片阳性的痰液及分离培养的纯结核分枝杆菌株标本363 例，其中男250 例，女113 例，年龄14～89 岁。

1.2 标本收集及结核分枝杆菌脱氧核糖核酸提取

1.2.1 痰液样本

留取患者痰液涂片抗酸染色阳性(2+以上)的痰液标本，以1∶1比例加入4%NaOH，混匀，液化20 min以上，3 000 r/min，离心20 min，弃上清，磷酸盐缓冲液(PBS)重悬沉淀，3 000r/min，离心10min，弃上清，1mL生理盐水重悬沉淀，12000 r/min，离心5 min，弃上清，加入250 μL结核分枝杆菌脱氧核糖核酸(TBDNA)提取液，99℃加热20min，12000r/min，离心5min，上清液为待测TB DNA样本。

1.2.2 纯结核分枝杆菌菌株

留取改良罗氏培养基上生长的典型结核分枝杆菌，刮取适量的菌落加入到250 μL TB DNA提取液中，99 ℃加热20 min，12 000 r/min，离心5 min，上清液为待测TB DNA样本。

1.3 熔解曲线法

严格按照厦门致善生物科技有限公司结核分枝杆菌利福平、异烟肼耐药突变试剂盒说明书进行样本的检测和结果的判读。吸取5 μL上述提取完成的TB DNA，加入到含20 μL聚合酶链式反应(PCR)的反应管中，放入SLAN-96S实时荧光PCR扩增仪(上海宏石医疗科技有限公司)进行扩增和熔解曲线分析。

1.3.1 PCR反应程序：

50 ℃ 2 min，1个循环；预变性95 ℃ 10 min，1个循环；95 ℃ 15 s，70 ℃ 20 s(每个循环下降1 ℃)，76 ℃ 25 s，13个循环；95 ℃ 15 s，57 ℃ 20 s，76 ℃ 25s，42个循环。熔解分析：95℃ 2min，40℃ 2 min，45～85 ℃(设置在此阶段每1 ℃采集1次荧光信号)，1个循环。

1.3.2 结果判读

当样本的熔解温度(Tm)与阳性对照的Tm一致(误差不超过1 ℃)时判定为野生型，即试验菌株对利福平/异烟肼敏感；样本的Tm与阳性对照Tm相差2 ℃及以上时判定为突变型，即试验菌株对利福平/异烟肼耐药。

1.4 观察指标

统计结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药率以及两种药物不同耐药突变位点发生频率。

2 结 果

结核分枝杆菌对利福平和异烟肼同时耐药的样本有63 例，耐药率为17.4%。单利福平耐药率为19.6%(71/363)，其中ropB(codon 507-512)，ropB(codon 521-528)，ropB(codon 513-520)，ropB(codon 529-533)突变频率分别为4.4%(16/363)，4.7%(17/363)，3.0%(11/363)和10.5%(38/363)；主要突变基因片段为ropB 529-533片段，另有3 例产生ropB codon 533特殊突变；传统结核分枝杆菌药物敏感试验显示对利福平敏感。单异烟肼耐药率28.1%(102/363)，其中AhpC启动子区(-44～-30位点)、AhpC启动子区(-15～3位点)、inhA94密码子、inhA启动子区(-17～-8位点)、KatG315密码子的突变频率分别是0(0/363)，3.3%(12/363)，0(0/363)，7.2%(26/363)和21.2%(77/363)，主要突变基因仍是inhA启动子区(-17～-8位点)和KatG315密码子。

3 讨 论

结核分枝杆菌耐药原因主要是基因、药物激活基因的启动子突变或者是药物靶点序列发生了突变。利福平耐药主要发生在ropB基因中一个大小为81个碱基对的利福平耐药决定区(RRDR)，95%以上的利福平耐药与此有关。利福平能抑制结核杆菌DNA依赖的RNA聚合酶活性，RNA聚合酶失活引起转录停止，结核分枝杆菌不能继续生长。大部分利福平耐药菌都是由于编码RNA聚合酶b亚基的基因某个特定区域发生突变[2]，从而不再与利福平结合而产生耐药性。异烟肼耐药主要与katG，inhA，ahpC等基因中的1个或多个突变有关[3]。本研究结果显示，结核分枝杆菌对利福平的耐药基因位点在ropB的529-533片段，异烟肼的耐药位点主要为inhA启动子区(-17～-8位点)和KatG315密码子，同时异烟肼的耐药率明显高于利福平，与国内一些研究报道相似[4-7]。2018年WHO报告[1]，利福平敏感菌株的异烟肼耐药率与2017年全球的耐多药/利福平耐药率相比，初治患者中前者明显高于后者(7.1%和3.5%)；但复治患者中前者明显低于后者(7.9%和18.0%)。Yuen等[8]通过对32个国家和地区的儿童结核病患者进行系统分析发现：儿童结核病患者中异烟肼耐药率高达12.1%，且大部分集中在西太区和东南亚地区。异烟肼耐药结核病在全球范围内处于一个比较严重的流行状态。

本研究仍存在一定的局限和不足。本研究是临床数据的总结，未对初治和复治进行分组；采用的是商品化试剂，仅对试剂包含的突变位点进行了分析总结，未能分析是否存在其他相关突变位点；研究对象数量有限，虽包含了各县及市区送来的样本，但总体送检率偏低，所以数据结果可能有偏倚。

综上所述，ropB 529-533，katG，inhA 3个耐药基因位点为突变频率较高的位点。耐药基因不同位点突变率在人群中存在一定差异，对临床诊断和选择调整耐药结核病患者治疗方案有一定的指导意义。本地区结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药率仍然较高，其中异烟肼耐药是个不容忽视的问题。