UPLC-MS/MS测定水和土壤中唑啉草酯及其代谢物的方法验证

杨志富，欧晓明，曾利红，汤 涛，梁 骥，侯根连，欧 将

（1.湖南化工研究院有限公司国家农药创制工程技术研究中心，长沙 410014；2.农用化学品湖南省重点实验室，长沙 410014；3.湖南化研院检测技术有限公司，长沙 410014；4.浙江省农业科学院农产品质量标准研究所，杭州310021）

唑啉草酯属于先正达开发的一种新苯基吡唑啉类除草剂，作用机理为通过抑制乙酰辅酶A羧化酶，造成植物脂肪酸生物合成受阻，使细胞生长分裂停止，破坏细胞膜含脂结构，导致杂草死亡。我国已于2010年登记用于防除冬小麦和春小麦以及大麦田一年生禾本科杂草[1-3]。唑啉草酯应用于田间后，主要的代谢产物有M2和M3，母体和代谢物均可能随雨水、淋溶等进入自然水体和土壤中，影响生物生长从而造成生态风险[4-5]。建立唑啉草酯及其代谢物M2、M3在水和土壤中的分析检测方法，旨在为该药剂在环境中的研究及风险评估提供技术支持。

目前关于唑啉草酯的报道多为合成[6-7]、应用技术[8-10]、质量控制[11]和在植物基质中的残留分析[12]，未见同时对其母体和代谢物在水和土壤中的检测方法。农药在环境介质中的残留量一般较低，普通的液相色谱分析方法的检出限难满足分析要求。笔者建立的超高效液相色谱-串联质谱分析方法具有更高的灵敏度，经验证可用于唑啉草酯及其代谢物M2、M3的环境归趋和环境毒理试验中农药残留分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

唑啉草酯标准品（纯度98.4%），国家农药质量监督检验中心（沈阳）；唑啉草酯代谢物M2标准品（纯度99.8%），北京科润天朗环境技术有限公司；唑啉草酯代谢物M3标准品（纯度99.3%），北京科润天朗环境技术有限公司。

1.2 仪器设备

Agilent 1290/G6470型三重四极杆液质联用仪、Agilent Eclipse plus C18色谱柱（2.1 mm×50 mm×1.8μm），美国安捷伦公司；LC-30A/LCMS-8050型超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪，日本岛津公司；SPS 402F型电子天平（0.01 g），梅特勒·托利多（常州）测量技术有限公司；AL204型电子天平（0.000 1 g），梅特勒·托利多国际贸易（上海）有限公司；Hei-vap型旋转蒸发仪，德国海道尔夫德祥科技有限公司；ACQUITY UPLCTMBEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm×1.7μm），美国沃特世科技有限公司。

供试水和土壤按相关要求采集、处理[13]，主要参数信息见表1。

表1 供试水和土壤主要参数信息表

1.3 分析检测方法

1.3.1 仪器方法

色谱条件：流动相A（0.1%甲酸水溶液）；流动相B（0.1%甲酸甲醇溶液）；柱温为40℃；进样体积为5 μL。梯度洗脱程序见表2[12,14]。

表2 液相梯度洗脱程序

质谱条件：离子源为ESI＋；检测方式为多反应监测；interface电压为4.0 kV；雾化器流速为3.0 L/min；干燥气流速为10.0 L/min；加热气流速为10.0 L/min；interface温度为300℃；DL温度为250℃；Heat Block温度为400℃。质谱信息见表3。

表3 农药质谱检测离子对信息

1.3.2 前处理方法

量取50 mL水样于250 mL分液漏斗中，加入10 g氯化钠，摇匀溶解，加入80 mL乙酸乙酯-二氯甲烷（1∶1，V/V，含1%0.1 mol/L盐酸），剧烈萃取3 min，上层清液过无水硫酸钠后收集于250 mL锥形瓶中，再用80、50 mL乙酸乙酯-二氯甲烷（1∶1，V/V）萃取2遍，合并上层清液并在50℃下旋蒸至近干。用5 mL乙腈-水（1∶1，V/V）定容，过膜，待LC-MS/MS检测。

称取5 g（精确至0.01 g）土壤样品于250 mL塑料离心管中，加入50 mL乙酸乙酯-乙腈（1∶1，V/V），再加入1 mL 0.1 mol/L盐酸，摇匀后超声5 min，离心，过无水硫酸钠后收集于250 mL圆底烧瓶中，再用50 mL乙酸乙酯-乙腈（1∶1，V/V）振荡提取2遍，每次30 min，随后离心，合并上清液至圆底烧瓶中，于50℃水浴中旋转蒸发至近干，冷却后用5 mL乙腈-水（1∶1，V/V）定容，过0.22μm有机相滤膜至进样瓶中，待LC-MS/MS检测。

2）几何模型建立范围为：上下游方向，以山梁山脊线为基线分别向河流上、下游方向；垂直河流方向，从河谷向山。建立有限元计算模型。

1.3.3 对照品溶液配制

分别配制唑啉草酯、唑啉草酯代谢物M2、唑啉草酯代谢物M3标准储备液（母液），然后配制1.0 mg/L的唑啉草酯、M2和M3的混合标准工作液（用色谱纯乙腈定容，2～8℃保存，有效期为1个月）。将该工作液用样品基质提取液逐级稀释，得到0.25、1.0、5.0、20、50、100μg/L的基质系列标准工作液（现配现用）。

1.4 方法验证

1.4.1 仪器方法

质谱条件：AJS-ESI＋为正离子扫描；离子喷雾电压为3.5 kV；雾化器压力为310.3 kPa；干燥气温度为5 L/min；干燥气流速5 L/min；鞘气流速为11 L/min；其他质谱条件与1.3.1中相似。

1.4.2 前处理方法

与1.3.2前处理方法相同。

1.4.3 线性与范围

将1.0 mg/L的唑啉草酯、M2和M3的混合标准工作液分别用乙腈-水（1∶1，V/V）和样品基质提取液逐级稀释配制成0.25、1.0、5.0、20、50、100μg/L质量浓度的溶剂系列标准溶液和基质系列标准溶液，制作标准曲线。

1.4.4 添加回收试验

在供试自来水和红壤土中进行加标回收试验，自来水添加浓度分别为0.1、1和1 000μg/L，红壤土中添加浓度分别为1、10和1 000μg/kg，每个浓度重复6次，同时设不加药的空白对照，按上述仪器条件和样品前处理方法进行分析检测。

2 结果与分析

2.1 线性试验结果和最小检出限

当基质效应小于20%，可使用溶剂标准曲线进行计算，否则需用基质标准曲线进行计算[15]。唑啉草酯、M2、M3的基质效应在自来水中为3.17%～20.10%，红壤土中为19.8%～53.0%。验证结果存在基质效应，需选择基质标标准曲线计算。取信噪比为3倍对应的待测物质量浓度作为检出限。自来水、红壤土中唑啉草酯的线性结果见表4，相关系数均大于0.990。结果表明，该方法线性关系较好、检出限低、灵敏度高。

表4 不同基质中3种分析物的线性相关性、检出限和定量限（n=6）

2.2 准确度、精密度试验结果

加标回收率试验结果，见表5。在自来水和红壤土中分别添加3个水平（低、中、高）3种物质的标准混合溶液，平行测定6次，以基质标为基准计算回收率。唑啉草酯、M2、M3在自来水中添加量为0.1、1.0、1 000μg/L时，平均回收率分别为86%～98%、81%～94%、96%～105%，相对标准偏差均小于9%；在红壤土中添加量为1.0、10、1 000μg/kg时，平均回收率分别为87%～100%、91%～104%、86%～104%，相对标准偏差在均小于7%，表明该方法回收率高，准确度好。

表5 自来水和红壤土中唑啉草酯、M2、M3的准确度和精密度结果（n=6）

2.3 再现性试验结果

根据相同方法进行回收率试验，自来水和红壤土中分别做了低、中、高3档添加浓度，每个浓度6次重复。结果显示，在自来水中的唑啉草酯日内和日间精密度分别为2%～10%和7%～11%；M2的日内和日间精密度分别为2%～6%和3%～4%；M3的日内和日度精密度分别为3%～8%和6%～10%。在红壤土中唑啉草酯的日内和日间精密度分别为3%～11%和4%～6%；M2的日内和日度精密度分别为2%～8%和1%～6%；M3的日内和日度精密度分别为2%～12%和6%～9%，均小于15%，表明该方法重复性好，精密度高。

2.4 选择和专属性试验结果

空白基质样品、最低档浓度标样、低档添加浓度质谱进样。结果表明，加标样品图谱中除3种标准物质峰外，未见其他杂峰产生有效干扰（图1、2），表明方法的选择性高、专属性好。

图1 自来水中唑啉草酯M2、M3子离子质谱图

2.5 耐用性试验结果

方法验证时对比了不同的仪器品牌、色谱柱型号、柱温等条件。结果显示，唑啉草酯、M2、M3含量的相对标准偏差小于1.0%，说明该方法的耐用性较好。

图2 红壤土中唑啉草酯M2、M3子离子质谱图

3 结 论

参照NY/T 3151—2017《农药登记土壤和水中化学农药分析方法建立和验证指南》[15]，笔者采用超高效液相色谱-串联质谱法建立了自来水和红壤土中唑啉草酯、M2、M3残留量的分析方法，并对其进行了验证。该方法的灵敏度、准确度和精密度、耐用性等均符合要求，方法简单、快速、准确，一次进样能检测唑啉草酯及其代谢物的残留量，满足环境试验中痕量样品低浓度的检测要求。