甘草愈伤组织诱导及带芽茎段丛生芽增殖条件优化

李伟　张东向　刘丽杰　吕晴　任艳波

摘 要：为筛选适于甘草愈伤组织诱导及带芽茎段丛生芽增殖的最佳激素配比，选取萌发能力最强的甘草种子作为试验材料，获得无菌苗，取其下胚轴和带芽茎段为外植体，在不同激素配比下诱导愈伤组织，统计愈伤组织的生长状况、颜色状态、诱导率和出愈率等指标，并研究不同激素对甘草带芽茎段丛生芽增殖的影响，统计带芽茎段丛生芽株高、节间距、真叶数、增殖倍数等指标。结果表明：MS+6BA 1.0 mg·L-1+2，4D 2.0 mg·L-1和MS+6BA 1.0 mg·L-1+NAA 2.0 mg·L-1有利于下胚軸愈伤组织的诱导，MS+6BA 0.2～0.6 mg·L-1有利于带芽茎段愈伤组织的形成;MS+6BA 1.8 mg·L-1对带芽茎段的生长最为有利，MS+6BA 1.0～2.2 mg·L-1有利于带芽茎段丛生芽的增殖，随着6BA浓度的升高，甘草带芽茎段丛生芽的增殖倍数也随之增加。

关键词：甘草;愈伤组织;带芽茎段;丛生芽;激素

中图分类号：S 567.23 文献标志码：A 文章编号：0253-2301（2021）10-0027-07

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.10.006

Optimization on the Callus Induction and Proliferation of Cluster Budsfrom Stem Segments with Buds of Glycyrrhiza Uralensis

LI Wei， ZHANG Dong-xiang*， LIU Li-jie， LYU Qing， REN Yan-bo

（College of Life Sciences and Agriculture and Forestry， Qiqihar University/Heilongjiang Key Laboratory of

Resistance Gene Engineering and Biodiversity Protection in Cold Areas， Qiqihar， Heilongjiang 161006， China）

Abstract： In order to screen the best hormone ratio for callus induction and the proliferation of cluster buds from the stem segments with buds of Glycyrrhiza uralensis， the seeds of Glycyrrhiza uralensis with the strongest germination ability were selected as the experimental materials to obtain the aseptic seedlings. The hypocotyls and stem segments with buds were taken as the explants to induce the callus under different hormone ratios， and the growth status， color status， induction rate and healing rate of callus were counted. Then， the effects of different hormones on the proliferation of cluster buds from the stem segments with buds of Glycyrrhiza uralensis were studied. And the indicators such as plant height， node spacing， number of true leaves and proliferation multiple of cluster buds from the stem segments with buds were counted. The results showed that MS+6BA 1.0 mg·L-1+2，4D 2.0 mg·L-1 and MS+6BA 1.0 mg·L-1+NAA 2.0 mg·L-1 were conducive to the induction of hypocotyl callus， and MS+6BA 0.2-0.6 mg·L-1 was conducive to the callus formation of the stem segments with buds. MS+6BA 1.8 mg·L-1 was the most beneficial to the growth of the stem segments with buds， and MS+6BA 1.0-2.2 mg·L-1 was conducive to the proliferation of cluster buds from the stem segments with buds. With the increase of 6BA concentration， the proliferation multiple of cluster buds from the stem segments with buds of Glycyrrhiza uralensis also increased.

Key words： Glycyrrhiza uralensis; Callus; Stem segments with buds; Cluster buds; Hormone

甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch为豆科Leguminosae甘草属Glycyrrihiza多年生草本植物，是中国传统医学中最古老和最常用的草药之一。它含有20多种三萜和300多种黄酮类化合物。近年来，研究表明从甘草中分离的活性化合物具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗炎、免疫调节功能，同时具有恢复和保护神经、消化、呼吸、内分泌和心血管系统的功效[1]。《中国药典》2020年版规定甘草有3个来源，即乌拉尔甘草G.Uralensis Fisch.、光果甘草G.glabra Linn. 及脹果甘草G.inflata Batalin.[2]。甘草具有多种药用价值[3]，由于过度和不可持续的采挖，甘草的野生资源减少得非常迅速，现在虽然甘草在中国西北部地区广泛种植[4]。但人工栽培易受外界环境影响，因此无性系育苗是保持亲本优良特性的首选途径，特别是植物组织培养方法具有生长周期短、外植体遗传背景一致性高、生长条件可控制等优势，可快速、高效的繁育种苗[5]。甘草成材需要2～5年，种子发芽率低，人工育种周期长，进行组织培养快速繁殖就成为对甘草保护性开发利用的最佳途径[6]。目前，对甘草愈伤组织诱导及带芽茎段丛生芽增殖条件有一定研究[7-8]。本试验研究不同激素对下胚轴及带芽茎段诱导愈伤组织的影响，以及不同激素对带芽茎段丛生芽增殖的影响，旨在筛选最佳激素配比，为甘草无性快繁提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

甘草种子由齐齐哈尔市昂昂溪区中草药种植基地提供，试验使用的药品未特殊标注均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 甘草无菌苗及外植体的获得 将甘草种子用蒸馏水浸泡25 min，再用0.1%升汞浸泡10 min，消毒后，在超净工作台内用无菌水淘洗5遍，每遍2 min，将无菌种子接种于经过灭菌的、未添加激素的MS培养基上，每瓶接种10粒，用封口膜封口后，放入恒温培养箱，温度25℃，暗培养，每天观察种子萌发情况，待种子萌发以后，无菌苗生长至5～10 cm，可用于外植体取材。

在无菌条件下，选择种子萌发能力最强且长势最好、茁壮、有节段的无菌苗，在超净工作台内用灭过菌的镊子取出，置于事先经高压灭菌冷却后的培养皿上，再用灭过菌的解剖刀和镊子取其下胚轴（0.7 cm）和带芽茎段（0.7 cm）。

1.2.2 不同激素配比对甘草下胚轴愈伤组织诱导的影响 将获得的下胚轴接种于添加不同浓度的6BA、2，4D、NAA且经过灭菌的MS培养基上，每瓶接种4个，培养基含3%蔗糖和0.8%琼脂糖，pH 5.8，温度25℃，光照周期16 h/d，光照强度2 000 lx，暗培养下则不提供光照。培养基中6BA、NAA和2，4D的浓度梯度见表1，下胚轴诱导愈伤组织共4种培养基，每种处理重复3次，21 d后观察愈伤组织诱导情况。

愈伤组织诱导率（%）=（形成的愈伤组织块数/接种外植体数）×100

1.2.3 6BA对甘草带芽茎段愈伤组织诱导的影响 将获得的带芽茎段接种于添加不同浓度6BA且经过灭菌的MS培养基上，每瓶接种4个，培养基含3%蔗糖和0.8%琼脂糖，pH 5.8，温度25℃，光照周期16 h/d，光照强度2 000 lx，暗培养下则不提供光照。

采用单因素试验设计方案，6BA浓度分别为：0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mg·L-1，每种处理重复3次，21 d后观察愈伤组织诱导情况。

1.2.4 不同激素对甘草带芽茎段丛生芽诱导和增殖的影响 （1）6BA对甘草带芽茎段丛生芽形成的影响。以MS+3%蔗糖+0.8%琼脂为基本培养基，6BA浓度分别为：0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2 mg·L-1，每瓶接种4个带芽茎段（0.7 cm），每种处理重复3次。（2）KT对甘草带芽茎段丛生芽形成的影响。以MS+3%蔗糖+0.8%琼脂为基本培养基， KT浓度分别为： 0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2 mg·L-1，每瓶接种4个带芽茎段（0.7 cm），每种处理重复3次。（3）6BA对甘草带芽茎段丛生芽增殖的影响。以MS+3%蔗糖+0.8%琼脂为基本培养基，6BA浓度分别为： 0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2 mg·L-1，每瓶接种4个带芽茎段（0.7 cm），每种处理重复3次。

增值倍数 =分化出丛生芽个数/接种带芽茎段数量

1.3 数据分析

利用Excel 2010进行统计和绘制图表，采用SPSS19软件进行数据方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同激素配比对甘草下胚轴愈伤组织诱导的影响

由表2可知，处理1愈伤组织诱导率最高为75%，褐化率为16.67%;处理3诱导率为66.67%，褐化率为16.67%。各组处理愈伤组织生长状况不同，处理1有3块达到最好（+++），3块较好（++），1块长势一般（+），2块褐化，处理3有4块最好（+++），2块一般（+），2块褐化，而处理2诱导率为33.33%，显著低于其他组合。方差分析表明，处理1与处理2和处理4在愈伤组织块数上存在显著差异，与其他组合没有显著差异;处理1与处理2在诱导率上存在极显著差异，与处理4在诱导率上存在显著差异，与其他组合没有显著差异;虽然处理3与其他组合在愈伤组织块数和诱导率上没有显著差异，但其诱导率较高，愈伤组织生长状态较好，且呈现疏松砂糖状。综合分析，选择MS+6BA 1.0 mg·L-1+2，4D 2.0 mg·L-1和MS+6BA 1.0 mg·L-1+NAA 2.0 mg·L-1作为继代培养的激素组合较为有利（图1）。

2.2 6BA对甘草带芽茎段愈伤组织诱导的影响

由表3可知，6BA浓度为0.2 mg·L-1和0.5 mg·L-1时，甘草带芽茎段愈伤组织的生长状态较好，褐化率维持在较低水平，分别为8.33%和25.00%，6BA浓度为1.0、1.5、2.0 mg·L-1时，愈伤组织生长状态不如前者，褐化率也显著高于前者，且伴有不同程度的木质化;6BA浓度在0.2～2.0 mg·L-1时，甘草带芽茎段均有愈伤组织形成，当6BA浓度为0.2 mg·L-1时形成的愈伤组织最好，白色砂糖状较多，褐化较少（图2）。

2.3 6BA对甘草带芽茎段丛生芽形成的影响

由表4可知，6BA浓度为0.2 mg·L-1和1.4 mg·L-1的培养基中，均没有丛生芽产生;6BA浓度为 1.8 mg·L-1时，带芽茎段株高、茎节数、真叶片数均达到最大，分别为9.87 cm、5.79个、6.44片，与其他浓度存在极显著差异;综上分析，6BA浓度为1.8 mg·L-1时对于甘草带芽茎段的生长最为有利。

2.4 KT对甘草带芽茎段丛生芽形成的影响

甘草带芽茎段在表5所示的KT浓度作用下均无丛生芽产生，但却长出根和愈伤组织。由表5可知，KT浓度为2.2 mg·L-1时，带芽茎段植株高、茎节数、真叶片数均达到最大，分别为9.24 cm、4.79个、5.37片，其中株高与其他浓度存在极显著差异;KT浓度在1.0～2.2 mg·L-1范围内，随着KT浓度增加，带芽茎段的株高、茎节数、真叶数均呈现升高趋势;说明KT对丛生芽诱导作用较小，但对带芽茎段的生长、生根和愈伤组织诱导均有促进作用（图3）。

2.5 6BA对甘草带芽茎段丛生芽增殖的影响

由表6可知，6BA浓度为0.2 mg·L-1和1.4 mg·L-1均没有丛生芽产生，这与丛生芽诱导的结果一致;6BA浓度为2.2 mg·L-1的培养基中，丛生芽增殖倍数为3.13倍，为各浓度培养基中最高;6BA浓度在1.0～2.2 mg·L-1范围内，随着6BA浓度增加，丛生芽的增殖倍数呈升高趋势;6BA浓度在0.6～1.8 mg·L-1范围内，随着6BA浓度增加，丛生芽高及真叶数呈升高趋势（图4）。

3 讨论与结论

种子萌发是植物体生活史中重要的阶段， 直接影响到植物体后期的生长发育和形态建成[9]，甘草种子的萌发受到温度、光照、水分、pH值、赤霉素和贮藏时间等条件的影响[10]。本试验采用未添加激素的MS培养基作为种子萌发的培养基，从而进一步获得无菌苗。愈伤组织的诱导率受一些内部和外部因子的影响，包括：基因型、营养成分、激素、生理状态和物理因子等。研究表明，甘草下胚轴、子叶、胚根均可作为外植体来诱导愈伤组织，其中下胚轴的愈伤组织无论从状态还是长势均为最好[11]。本研究采用甘草下胚轴为外植体，愈伤诱导率最高可达77.78%，这与已有报道一致。甘草带芽茎段诱导丛生芽试验中，仅选取6BA和KT两种植物激素，其他激素仍可做深入研究。

在植物组培快繁中，生长素和细胞分裂素等生长调节剂对培养物的诱导分化起重要作用[12]。张洋等[13]研究显示MS+6BA 1.0 mg·L-1 +2，4D 2.0 mg·L-1唐古特大黄外植体出愈率最高，且生长快;杨曼等[14]研究表明在富民枳组织培养时，MS+6BA 1.0 mg·L-1 +NAA 2.56 mg·L-1时富民枳愈伤情况最佳;文沛玲等

[15]在研究不同浓度6BA对黑麦草种子出愈率的影响时得出，在一定的浓度范围内，MS+6BA能够提高多年生黑麦草愈伤组织的出愈率，但随着浓度的增加反而会降低黑麦草愈伤组织的出愈率，且6BA浓度均处于较低浓度水平;魏晓雪等[16]研究表明带芽茎段为百里香组培的最佳外植体材料;刘雪莲等[17]只添加细胞分裂素6BA的MS培养基丛生芽诱导率高于添加了细胞分裂素和生长素的MS培养基， 但芽丛长势弱;张延红等[18]研究显示6BA 的浓度对丛生芽的颜色、数目、生长速度和健壮度的影响十分显著;杨澜等[19]研究表明浓度为2.0 mg·L-1的

6BA处理后的叶艺丛生芽经过成苗培养后，其芽苗的生物增长量均高于6BA的其他浓度处理。KT在植物组织培养中具有促进生根的作用，但芽苗茎节间细长，叶片狭长且根细长，芽苗并不健壮，不利于后期的出瓶移栽。

本试验研究了不同激素配比对愈伤组织诱导及带芽茎段丛生芽增殖的影响，结果表明，激素对愈伤组织诱导作用明显，在下胚轴诱导愈伤组织的试验中，MS+6BA 1.0 mg·L-1+2，4D 2.0 mg·L-1出愈率最高，但褐化率也较高，MS+6BA 1.0 mg·L-1+NAA 2.0 mg·L-1出愈率为其次，但褐化率较低，且愈伤组织长势比MS+6BA 1.0 mg·L-1+2，4D 2.0 mg·L-1好;低浓度的6BA对甘草带芽茎段愈伤组织诱导有利，随着浓度的升高，虽然愈伤组织诱导率均为100%，但褐化明显，长势不好;6BA濃度为1.8 mg·L-1时甘草带芽茎段的株高、节段、节间距、真叶各项指标均最高，说明此浓度对于甘草带芽茎段的生长最为有利;不同浓度6BA和KT对带芽茎段丛生芽诱导的结果表明：6BA对丛生芽的诱导有利，而KT的作用较小。本试验为甘草快繁提供了理论依据，为快繁体系的建立和优选奠定基础，对甘草的工厂化规模生产、加快产业化进程起到了促进作用。

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（责任编辑：柯文辉）

收稿日期：2021-08-02

作者简介：李伟，男，1984年生，硕士，工程师，主要从事植物生理学与植物生物技术研究。

*通信作者：张东向，男，1963年生，硕士，教授，主要从事植物生理学与植物生物技术研究（E-mail：zhangdx1019@163.com）。

基金项目：黑龙江省省属高等学校基本科研业务费科研项目 （YSTSXK201887）;齐齐哈尔市科技攻关项目（SFGG201575）;齐齐哈尔大学研究生创新项目（YJSCX2019044）。