14株乳酸菌产酸抗盐特性研究

罗丽蓉 李宏洋 李升

摘 要：乳酸菌特别是乳杆菌是泡椒发酵过程中的风味微生物。为探究乳酸菌的产酸特性，研究选取从发酵辣椒产品中分离筛选的14株乳酸菌作为试验材料。通过测OD值、pH、消耗碱的量、活菌数，对14株乳酸菌的生长繁殖、产酸强弱、总酸度、抗盐性进行分析比较。结果表明，编号为5-1（Lactobacillus plantarum）和29-1（Lactobacillus alimentarius） 的2株菌生长性能好、产酸能力强且适合低盐环境生长，因此可作为纯种强化低盐发酵泡椒的优良菌种。

关键词：乳酸菌;生长性能;pH;产酸特性;抗盐性

中图分类号：TS201.3

文献标识码：A

文章编号：1008-0457（2021）06-0076-05

国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2021.06.011

Abstract：Lactic acid bacteria，especially Lactobacillus，are the flavor microorganism in the fermentation process of pickled pepper.In order to explore the acid-producing properties of lactic acid bacteria，14 strains of lactic acid bacteria isolated and screened from fermented pepper were selected as experimental materials.The growth and reproduction，acid production strength，total acidity and salt resistance of 14 strains of lactic acid bacteria were analyzed and comparedby measuring the OD value，pH，consumption of the alkali and viable count.The results showed that the strains numbered 5-1（Lactobacillus plantarum） and 29-1（Lactobacillus alimentarius） had good growth performance，strong acid production capacity，and were suitable for low salt environment，so they could be used as excellent strains of pure strain to enhance low salt fermentation of pickled pepper.

Keywords：lactic acid bacteria;growth characteristic;pH;acid production;salt resistance

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是一类细菌的总称，这类细菌都能够发酵糖类[1]产生乳酸（主要产物），其共同特征是过氧化氢酶阴性、革兰氏染色阳性[2]。乳酸菌可分为乳杆菌属、链球菌属、双歧杆菌属和片球菌属等[3]，其中乳杆菌属和双歧杆菌属与人类身体健康有密切联系[4-5]。

乳酸菌能促进动物生长[6]，调节胃肠道菌群，维持微生态平衡[7]，从而改善肠道功能[8]，提高食物消化率[9]和生物效价，防止便秘[10]，降低血清胆固醇和血脂[11]，预防心脏病，控制内毒素，抑制肠道内腐败微生物的生长[12]，促进乳糖消化，调节机体免疫力，延缓机体衰老和抗肿瘤等作用[13]。

乳酸菌是酸奶、泡菜、酸菜、乳制品的主要发酵剂。如今，乳酸菌发酵食品被人们广泛食用，人们对其健康也越来越关注。乳酸菌发酵食品的生产应引起广泛的重视，同时乳酸菌的发展对发酵食品专业化和安全化有积极的推动作用[14]，对丰富和挖掘传统菌剂具有重要的现实意义。因此筛选对微生物发酵有益的菌种已经成为当前研究发展的热门趋势。

1 材料與方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株

待测14株乳酸菌为实验室保藏菌种，有植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、食品乳杆菌（Lactobacillus alimentarius）、戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）、希氏乳杆菌（Lactobacillus higardii）、纳木雷氏乳杆菌（Lactobacillus namurensis）、副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）、哈尔滨乳杆菌（Lactobacillus harbinensis），编号为5-1（Lactobacillus plantarum）、16-1（Lactobacillus plantarum）、10-1（Lactobacillus alimentarius）、19-2（Lactobacillus alimentarius）、25-1（Lactobacillus alimentarius）、28-1（Lactobacillus alimentarius）、29-1（Lactobacillus alimentarius）、16-4（Lactobacillus pentosus）、19-1（Lactobacillus pentosus）、21-3（Lactobacillus pentosus）、5-4（Lactobacillus higardii）、9-1（Lactobacillus namurensis）、9-3（Lactobacillus paracasei）、21-4（Lactobacillus harbinensis）。

1.1.2 培养基

MRS培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，葡萄糖20 g，乙酸钠5 g，柠檬酸氢二氨2 g，吐温80 mL，磷酸氢二钾2 g，硫酸锰0.25 g，硫酸镁0.58 g，琼脂18 g，蒸馏水1000 mL，pH（6.2～6.6），121 ℃灭菌20 min。

1.1.3 仪器与试剂

仪器：PHS-3C酸度计、高压蒸汽灭菌锅、振荡培养箱、超净工作台、分光光度计、碱式滴定管、4 ℃冰箱。

试剂：酚酞、0.1 mol/L的盐酸、pH=4.0的缓冲液。

1.2 试验方法

OD值测定方法：取已灭菌的MRS液体培养基3 mL作为空白对照，将已活化的14株菌液将其OD值稀释至0.03左右，然后按3%的接种量，往80 mLMRS液体培养基中接入待测菌株，37 ℃振荡培养。用分光光度计每2 h测定菌悬液在波长680 nm处的OD值。

pH值测定方法：用 PHS-3C精密酸度计，每2 h测各菌液的pH值。

酸度测定方法：每2 h取菌液，按酸碱滴定消耗碱的体积来测定乳酸菌的酸度。以吉尔涅尔度（°T） 来表示乳酸菌的酸度，即每100 mL发酵液消耗1 mL 0.1 mol/L NaOH 溶液，记为°T[15]。

抗盐性测定方法：将挑选的7株菌活化并进行盐敏感测试，按3%的接种量分别接种于0% NaCl、1% NaCl、3% NaCl、5% NaCl的MRS液体培养基，以37 ℃、180 r/min于振荡培养箱培养2 h，按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的梯度进行稀释，然后取10-6的菌液0.1 mL分别均匀涂布于含空白、1% NaCl、3% NaCl、5% NaCl的MRS固体培养基，在恒温培养箱培养48 h，最后采用平板计数法计算活菌数目并对数据进行分析比较，以此来确定各乳酸菌生长的最适盐浓度及抗盐能力。

根据测定菌悬液的OD值、pH值、酸度和活菌数来制作乳酸菌生长曲线图、pH值变化趋势图、酸度变化趋势图、抗盐统计表。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的生长曲线

14株乳酸菌生长曲线的测定结果如图1所示。可見，14株菌的OD值在培养初始没有明显的变化，待到6 h之后14株乳酸菌几乎都开始大量生长繁殖并且进入对数生长时期，但培养20 h后各菌株的生长逐渐变慢，然后到达稳定期。

由表1可知各菌株之间生长速度没有显著差异（F=1.038，P=0.418>0.05），但不同时间乳酸菌的生长速度有显著差异（F=67.879，P=0<0.05）。在14株乳酸菌中，其中5-1、29-1这2株菌的对数生长期开始的最早，培养4 h后开始，从4～16 h这2株菌都快速增长，16～48 h生长速度几乎一直保持不变。而19-1菌株的对数生长开始的较晚，培养10 h后进入对数生长期且一直持续到48 h，说明此菌的适应时间较长，对于要缩短发酵周期的试验，显然是劣势菌。总的来说，不同的乳酸菌耐酸能力有所不同，因此不同乳酸菌的生长繁殖也表现出一定的差异性。对不同时间的14株菌的生长状况进行多重比较，结果表明5-1、29-1这2株菌生长性能较好，而9-1、16-1、16-4、21-4、25-1这5株菌的生长性能较差，因此，筛选出5-1和29-1这2株生长繁殖旺盛的菌株。

2.2 乳酸菌的pH变化

pH在一定程度上可反映乳酸菌的产酸性能，14株乳酸菌的pH变化如图2所示。在培养早期（0～4 h）14株乳酸菌的pH变化不明显，4 h后14株乳酸菌pH开始下降，在4～18 h pH快速下降，即处于对数生长期，同时此阶段菌体生长快速、代谢加快。表明乳酸菌开始大量繁殖，产酸量迅速升高，同时菌体的代谢速度也加快。在18～24 h时，pH下降变缓，产酸能力减弱，表明细菌代谢减慢，菌体生长已进入稳定期。由表1可知，不同乳酸菌菌株pH变化差异不显著（F=1.407，P=0.162>0.05）。不同时间乳酸菌pH变化差异显著（F=63.751，P=0<0.05）。

对不同时间的14株乳酸菌的pH进行多重比较，如图2所示，5-1、29-1这2株乳酸菌的pH在4～16 h下降较快、持续时间长。在18～48 h，pH几乎不变。其中5-1菌株的pH在4～18 h都下降较快，且5-1菌株的pH曲线图最陡，因此该阶段5-1菌株产酸速度和产酸量最大且明显优于其他菌株，16 h后开始进入稳定期，产酸速度减小，但产酸量还在增加。5-4菌株的pH下降较快的时间段为培养后的10～26 h，该菌株用于微生物发酵将延长发酵时间。29-1在4-16 h期间pH下降的较快，之后便进入稳定期，同时剩余乳酸菌的pH也有所下降，但下降速度较缓慢。分析发现整个过程几乎与乳酸菌的活菌数变化情况大体一致。

2.3 乳酸菌酸度变化

酸度在一定程度上也能反映菌株的产酸性能。酸度越大，产酸性能越强，环境的pH也会随之降低。14株乳酸菌48 h内酸度变化如图3所示，可看出14株乳酸菌的酸度变化有一定差异性。总的来看，14株乳酸菌在4～36 h产酸速度逐渐增加，此阶段处于乳酸菌对数生长期。在36～48 h，乳酸菌的产酸量基本保持不变，菌体的生长从对数期进入到稳定期，之后进入衰亡期。同时，由表1可知，14株菌酸度变化有显著差异（F=7.18，P=0<0.05），不同时间各菌株的产酸量也存在显著差异（F=133.381，P=0<0.05）。

对不同时间各株乳酸菌酸度进行多重比较，可以看出5-1、28-1、29-1这3株乳酸菌的产酸能力较强，且产酸量较高的时间段为8～36 h。其中5-1菌株产酸量从6～48 h不断上升并持续到48 h之后，若要将5-1作为优势菌株，一定要控制好该菌株的后酸化。9-3菌株从8～36  h产酸速度快速增加，36～48 h产酸速度缓慢增加，且一直有增加的趋势。28-1菌株是从4～14 h产酸量快速增加，14～18 h产酸量几乎不变，18～48 h产酸量又快速增加。29-1菌株从4～36 h产酸量不断增加，36～48 h产酸量几乎不变。从图中也可看出，其余8株菌的产酸能力相对较弱。14株菌在不同的时间产酸量各不相同，因此应根据实际需要选择恰当的时间添加乳酸菌株。

2.4 鹽敏感测试

不同菌株在不同盐浓度中的活菌变化情况如表2。

由表2可以看出，这7株乳酸菌的盐耐受能力由高到低依次为：28-1>21-3>5-1>16-4>29-1>19-2>10-1。已有研究表明：H+-ATPase在乳酸菌株处于不良盐环境下时，可以有效调节渗透压，因此对菌株的耐盐性有重要作用。当细胞处于逆环境时，要调节细胞内环境的渗透压，必然需要质子泵为跨膜运输提供动力，一般认为阳离子的跨膜调节是通过H+-ATPase来完成[16]，从而来调节细胞膜两侧的渗透压。可见，菌株的耐盐性与H+-ATPase酶活有密切关系，因此不同菌株表现不同的耐盐性是合理的[17]。

3 结论与讨论

本试验有7个种的乳杆菌，其中植物乳杆菌的产酸性能最强，植物乳杆菌也常存在于发酵的蔬菜和果汁中[18]，是传统酱腌菜中的优势菌[19]。人体肠道常见的乳杆菌，如植物乳杆菌，它对调节人体健康有积极作用，同时也是目前研究和关注的热点之一[20]。乳酸菌除了具有产酸性能外，还具有降解亚硝酸盐、富硒性能、酸应激性、抑菌性、预防贫血等众多性能[21]，但产酸性能是评价乳酸菌优良的基本指标，因此本试验测了14株菌的生长曲线、pH、酸度和抗盐性。

本试验通过测OD值得出5-1、29-1在4～16 h时，菌体数目迅速增加，这可能是由于发酵初期，培养液酸度较低，环境非常适合乳酸菌的生长[22]。结果表明，若将这2株菌用于食品发酵中可能缩短发酵时间提高发酵的效率。通过测pH得出5-1、29-1这2株乳酸菌具有明显的优越性。结果表明，若有较强的生长繁殖能力，那么也会导致其有较强的产酸能力，因此可通过控制菌体的数量的来控制发酵食品的酸度和后酸化，同时解决后酸化问题是当前乃至未来需关注的热点问题。通过测发酵液的总酸度得出5-1、29-1这2株菌在4～36 h产酸速度迅速增加，随着乳酸含量升高，酸度上升变快[23]。在36～48 h时，5-1、29-1这2株乳酸菌的生长从稳定期进入衰亡期，这可能是由于发酵中期和后期，随着乳酸菌的不断繁殖，酸度不断升高，导致高酸度环境对乳酸菌的生长有不同程度的抑制作用[24]。通过对平板活菌数的记录、统计和分析，得出5-1、29-1适合低盐环境生长，而21-3、28-1适合在高盐环境。高盐食品会导致高血压、心脑血管等疾病，因此可得出5-1、29-1是低盐纯种强化发酵的最佳菌株。

综上所述，通过对14株乳酸菌产酸指标的测定，得出5-1（Lactobacillus plantarum）和29-1（Lactobacillus alimentarius）这2株菌的生长繁殖能力强、产酸能力强且适合低盐环境生长，因此可将这2株优良菌株用来作为发酵泡椒、酸奶、泡菜等发酵食品的优良菌种，同时这2株菌也可作为进一步研究与应用的备选菌株，深入探索和挖掘其产酸的调控机制和产生对人体健康有益的物质。

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