百日咳杆菌核酸检测试剂国家参考品的研制

夏德菊，周海卫，王薇，许四宏

中国食品药品检定研究院传染病诊断试剂二室，北京100050

百日咳是由鲍特菌属中的百日咳鲍特菌（Bordetella pertussis，Bp）引起的急性呼吸道疾病，传染性较强，诊治不及时会导致严重后果，严重威胁人类健康［1］。尽管世界上绝大多数国家己实施了百日咳疫苗的免疫接种，但据世界卫生组织统计报道，目前全世界每年仍有相当数量的百日咳患者，许多地方还出现了暴发性流行，即“百日咳再现（remeger）”［2］。因此，对百口咳进行早期、快速、准确的实验室诊断显得尤为重要。

目前临床上用于百日咳杆菌检测最常用的方法有细菌培养法、血清学检测、分子生物学检测等［3］。病原学诊断的金标准是根据在卡他期和痉咳初期获得的鼻咽部样本中找到百日咳杆菌。该方法虽然特异性较好，但敏感性较低，操作技术要求高，且需培养3 ～7 d 才能出结果［4］。免疫学检测特异性高，但其结果的解释困难，且受病程、患者年龄及是否接种疫苗影响［5］。以PCR 为基础的分子诊断方法对临床上难于分离培养的病原菌可进行快速、准确的鉴定，对疾病的早期诊断及合理用药具有很大的辅助作用。核酸扩增技术应用于百日咳诊断以来，在对百日咳鲍特菌的早期诊断方而显示出巨大的优势，值得临床推广［6］。

目前，国内已有超过10 家企业研制出百日咳杆菌核酸检测试剂，正处于注册或临床试验阶段，截止至2020 年8 月，获得医疗器械注册证的试剂1 个。这些试剂大多是基于PCR-荧光探针法，个别是熔解曲线法。国内外研究用于构建引物的百日咳DNA有PT 基因启动子区域、重复插入序列（repeated insertion sequences，IS）、Prn 基因上游 DNA 区域和腺苷酸环化酶毒素基因［7-8］，根据前期调研，实际在试剂中以IS 和PT 基因启动子区域为基础设计的引物居多。插入序列IS481 在百日咳杆菌基因组中有50 ～200 个拷贝，作为核酸检测目的基因有很高的灵敏度，但也有报道发现，在其他鲍特菌属中也存在IS481 序列，特异性有待进一步论证［9］。因此，也有试剂为了提高特异性选用PT 基因启动子区作为靶基因［10］，该基因在鲍特菌属（百日咳杆菌、副百日咳杆菌、支气管炎鲍特菌）中仅有1 个拷贝，各菌种之间仅有几个基因差异，但只有在百日咳杆菌中，启动子区能够启动，表达百日咳毒素，其他细菌中该启动子不能启动。选取此区作为靶基因，虽然能够降低非特异性，但对试剂灵敏度的考验很大。但有文献表明，高浓度的支气管炎鲍特菌和副百日咳杆菌也能检测到PT 基因启动子区的交叉反应性［11］，因此，目前也有不少选取百日咳杆菌其他保守区域作为靶区的试剂，以进一步提高特异性［12-13］。

鲍特菌属种类较多，临床症状相似，准确的鉴别诊断对百日咳治疗用药的选择以及疫苗评价十分关键［14-15］。目前，百日咳核酸检测试剂的研究越来越受到关注，因此，研制百日咳杆菌核酸检测试剂国家参考品，以规范此类试剂的注册检验，加强对此类试剂的质量控制和监管十分必要。本研究旨在建立百日咳杆菌核酸检测试剂国家参考品，并确定其质量标准。

1 材料与方法

1.1 原料 为临床样本分离培养物和ATCC 标准菌株，均为纯菌落，由广东和信健康科技有限公司和首都医科大学附属北京儿童医院惠赠。共计21 份，编号PB1 ～PB21，样本信息见表1。

表1 原料样本信息Tab.1 Data onraw material samples

1.2 主要试剂及仪器 细菌DNA 提取试剂盒为美国 Magen 公司产品；Phusion Hot StartⅡDNA Polymerase 为美国 ThermoFisher 公司产品；QIAquick Gel Extraction Kit 为德国QIAGEN 公司产品；原料验证试剂为生物梅里埃呼吸道感染性病原体核酸检测试剂盒（封闭巢式多重 PCR 熔解曲线法）、绍兴迅敏康生物科技有限公司百日咳杆菌核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）、广东和信健康科技有限公司百日咳杆菌核酸及耐药突变位点检测试剂盒（PCR-荧光探针法）、圣湘生物科技股份有限公司百日咳杆菌核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）、北京卓城惠生生物科技股份有限公司百日咳杆菌核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）、广州赛哲生物科技股份有限公司百日咳杆菌（BP）核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）、深圳亿立方生物技术有限公司百日咳杆菌核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）；协作标定试剂除上述原料验证试剂外还有上海捷诺生物科技十六项呼吸道病原体核酸检测试剂盒（熔解曲线法）、中山大学达安基因股份有限公司百日咳杆菌核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）、上海之江生物科技股份有限公司百日咳杆菌核酸测定试剂盒（荧光PCR 法）、北京卓城惠生生物科技股份有限公司肺炎支原体 ／ 百日咳杆菌核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）；荧光PCR 仪为美国ABI 公司产品；普通PCR 仪为珠海黑马公司产品。

1.3 原料复核 原料样本于80 ℃水浴灭活1 h。将PB7 ～PB21 用TE 缓冲液进行 100 倍稀释，与未稀释的PB1 ～PB6 样本分发给7 个原料验证试剂生产厂家进行检测，PB1 ～PB6 样本用无菌生理盐水按1 ∶101、102、1 ∶103、1 ∶104、1 ∶105、1 ∶106进行梯度稀释后使用，其余样本直接使用，按照各试剂盒说明书进行样本提取和扩增，上报检测结果。

1.4 原料确证 对于原料复核不一致的样本，选取百日咳杆菌（样本编号：PB4）和副百日咳杆菌（样本编号：PB16）作为对照，参照文献［16-18］，设计 3 种菌株特异性引物以及通用引物，提取基因组DNA，分别用4 对引物扩增支气管炎鲍特菌、百日咳杆菌阳性、副百日咳杆菌和水，引物序列及扩增基因片段长度见表2。反应体系为：Green Taq Mix 20 μL，10 μmol ／ L 引物各 2 μL，模板 DNA 5 ng，加重蒸馏水至 50 μL。反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃30 s，72 ℃ 30 s，共 30 个循环；72 ℃ 7 min。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析。

表2 原料确证引物序列Tab.2 Primer sequences for raw material confirmation

1.5 阳性原料样本的关键抗原位点等位基因分析根据Prn 基因形成GGxxP 结构数量不同以及特定位置（如 102、260、337、532 及 853 位）氨基酸的不同，将 Prn 基因分为 Prn1 ～ 12 亚型［19］，而且百日咳杆菌ptxP 区域呈现一定多态性，根据特定位置突变碱基不同，将百日咳杆菌ptxP 分为11 个亚型［19-20］。采用Premier 5.0 软件设计相应引物，引物序列见表3。提取细菌基因组DNA，PCR 扩增各种目的基因，ptxp、ptxA、fim2、fim3 和 tcfA 基因扩增片段长度分别为 573、934、691、796 和 535 bp；prn 基因先进行外侧片段扩增，扩增片段为1 429 bp，当外侧无扩增时，再进行内侧扩增，扩增片段为1 020 bp。ptxp、ptxA、fim2、fim3 扩增反应体系为：5 × Phusion HF Buffer 10 μL，2.5 mmol ／ L dNTP mix 4 μL，10 μmol ／ L 引物各2 μL，Phusion DNA Polymerase（2 U ／ μL）0.5 μL，模板DNA 0.2 ng，加重蒸馏水至50 μL。反应条件：98 ℃ 3 min；98 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共 30个循环；72 ℃ 5 min。prn 外侧、tcfA 扩增反应体系为：5 × Phusion GC Buffer 10 μL，5 mol／L Betaine 10 μL，2.5 mmol／L dNTP mix 4 μL，10 μmol／L 引物各 2 μL，Phusion DNA Polymerase（2 U ／μL）0.5 μL，模板 DNA 0.2 ng，加重蒸馏水至50 μL。反应条件和上述4 个基因片段一致。prn 内侧扩增反应体系和反应条件与prn 外侧相同。PCR 产物经2%琼脂糖电泳检测，将每种靶基因特异性扩增片段与预期的目的基因片段大小相一致的进行PCR 产物纯化，并送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

表3 各抗原位点引物序列Tab.3 Primer sequences of various antigen sites

1.6 阳性原料样本红霉素耐药位点检测 已知红霉素以及新一代大环内酯类药物是抗百日咳杆菌的一线治疗药物。大环内酯类药物的结合位点位于23S rRNA 结构域Ⅴ，此区域发生的核苷酸点突变会降低抗生素和核糖体之间的亲和力，从而使百日咳杆菌产生耐药性。目前已发现有耐药株对红霉素、阿奇霉素、克拉霉素耐药，耐药株23S rRNA 序列均发生 A2047G 红霉素耐药位点改变［27-28］。因此参照文献［27］，采用Premier 5.0 软件设计相应引物，引物序列为 1505F：5′-GGCACGAGCGAGCAAGTCTC-3′；2118R：5′-TCTGGCGACTCGAGTTCTGC-3′。提取细菌基因组DNA，扩增目的基因，片段长度为615 bp。反应体系为：5 × Phusion HF Buffer 10 μL，2.5 mmol ／ L dNTP mix 4 μL，10 μmol ／ L 引物各 2 μL，Phusion DNA Polymerase（2 U ／μL）0.5 μL，模板 DNA 0.2 ng，加重蒸馏水至 50 μL。反应条件：98 ℃ 3 min；98 ℃10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共 30 个循环；72 ℃ 5 min。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，切胶回收纯化目的片段，送生工生物工程（上海）股份有限公司测序比对。

1.7 百日咳杆菌CFU 定值 将PB2 的临床分离株进行培养传代，三角瓶摇床培养扩增菌落，3 913 × g离心 5 min，PBS 重悬菌液至 40 mL，10 倍梯度稀释至 1 ∶106，涂布 1 ∶105、1 ∶106梯度各 2 板，100 μL ／板，以菌落数量在30 ～300 的平板计算原液菌浓度。

1.8 百日咳杆菌核酸检测试剂国家参考品的组成、分装和组装 将筛选和确证的阳性原料用TE 缓冲液适当倍数稀释后作为阳性参考品；将筛选和确证的阴性原料用TE 缓冲液适当倍数稀释后作为阴性参考品；对上述经接种计数的1 株百日咳杆菌样本用 TE 缓冲液稀释至 1 × 107cfu ／ mL，作为最低检出限参考品；继续稀释至 1 × 105cfu ／ mL，作为精密度参考品。将制备好的样本0.5 mL ／ 支分装于1.0 mL 进口冻存管中，其中精密度参考品分装量为1 mL ／ 支，组装为成套百日咳杆菌核酸检测试剂国家参考品；其外包装采用50 支 ／ 盒的包装盒；参考品标签全部为不干胶标签。组装后参考品样品保存于-20 ℃冷库中备用。

1.9 百日咳杆菌核酸检测试剂国家参考品协作标定 将组装好的参考品分发给协作标定试剂生产厂家，各家单位按照产品说明书进行检测，其中阴阳性以及精密度参考品直接使用，最低检出限参考品用无 RNA 酶的去离子水进行 1 ∶102、1 ∶103、1 ∶104、1 ∶105及1 ∶106稀释，再作为待测样品使用。所有厂家在规定时间内上报检测结果，依据检测结果拟定本参考品的质量标准。

1.10 百日咳杆菌核酸检测试剂国家参考品的均匀性评估 在分装前后，随机抽取百日咳杆菌核酸检测试剂国家参考品中2 支阳性参考品，1 支阴性参考品和精密度参考品各5 支（抽样分布：前段2 支、中段1 支、后段2 支），对这4 份样本的各5 支样品用深圳亿立方生物技术有限公司的百日咳杆菌核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）进行检测，每支样本检测3 次，计算检测结果的变异系数（CV），要求各样本15 次检测结果的CV 小于5%。

1.11 百日咳杆菌核酸检测试剂国家参考品的稳定性评估 取出-20 ℃保存的最低检出限样本和精密度参考品各2 支，分别于4 ℃放置5 d、反复冻融3次处理，与-20 ℃保存的参考品同时用深圳亿立方生物技术有限公司的百日咳杆菌核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）进行检测，要求最低检出限样本用无 RNA 酶的去离子水进行 1 ∶102、1 ∶103、1 ∶104、1 ∶105稀释，再作为待测样品使用，比较3 种储存条件下检测结果的CV，要求CV 小于5%。

2 结 果

2.1 原料复核 编号为PB1 ～PB10 的原料所有企业均检出百日咳杆菌阳性，且广东和信健康百日咳杆菌核酸及耐药突变位点检测试剂盒（PCR-荧光探针法）检测 PB1 ～ PB3、PB7 和 PB9 为红霉素耐药突变位点阳性。样本编号PB11 ～PB21 的原料除PB17有2 家试剂检出百日咳杆菌阳性外，其余样本所有试剂均检为百日咳杆菌阴性。初步判断PB1 ～PB10为百日咳杆菌阳性样本，PB11 ～PB16 和 PB18 ～PB21 为百日咳杆菌阴性样本。

2.2 原料确证 PB17 样本为支气管炎鲍特菌，有2家试剂检出百日咳杆菌阳性，经3 对特异性引物和1 对通用引物对支气管炎鲍特菌、百日咳杆菌阳性、副百日咳杆菌和水进行扩增，PB17 为支气管炎鲍特菌纯菌落，PB16 为副百日咳鲍特菌纯菌落，见图1。

图1 原料确证电泳图Fig.1 Electropherogram for raw material confirmation

2.3 阳性原料样本的关键抗原位点等位基因分析本参考品的阳性原料共发现prn 4 种基因亚型，即prn1、prn2、prn3 和 prn6，以 prn1 为主。阳性原料绝大部分是 PtxP1 型，占 70%，2 株是 PtxP4 型，1 株是PtxP3 型。tcfA 基因测序结果显示，除2 株为tcfA2型，其余均为 tcfA1 型。fim2、fim3 分型结果均为fim2-1 和fim3 A 型。根据上述5 个基因序列分析结果，本次用于参考品的阳性原料样本共有4 种等位基因组合型：PtxP1 ／prn1 ／fim2-1 ／fim3 A ／tcfA2、PtxP4 ／prn6 ／ fim2-1 ／ fim3 A ／ tcfA1、PtxP3 ／ prn2 ／ fim2-1 ／fim3 A ／tcfA2 和 PtxP1 ／prn3 ／fim2-1 ／fim3 A ／tcfA2，所占比例分别为 60%（6 ／ 10）、20%（2 ／ 10）、10%（1 ／ 10）和 10%（1 ／ 10）。

2.4 阳性原料样本红霉素耐药位点检测 本研究中的10 份阳性百日咳杆菌23S rRNA 2047 基因位点突变测序结果为：PB1 ～ PB3、PB7 和 PB9 共 5 份样本发生了点突变，为红霉素耐药菌株，此结果与原料复核时选用的广东和信健康百日咳杆菌核酸及耐药突变位点检测试剂盒（PCR-荧光探针法）检测情况一致。

2.5 百日咳杆菌CFU 定值 已知1 ∶105稀释涂布2 个平板菌落数均多不可计，1 ∶106稀释涂布 2 个平板菌落数为74 和91，因此选取10-6稀释梯度计算原液浓度，PB2 原料经复苏、富集培养后浓度为8.3 ×108CFU ／ mL，未用完原料于-80 ℃保存，保证参考品换批时的一致性。

2.6 百日咳杆菌核酸检测试剂国家参考品的组成经复核和确证的阳性原料PB7 和PB9 用TE 缓冲液经 1 ∶1 000 稀释、PB8 经 1 ∶500 稀释、其余样本经1 ∶100 稀释，作为本套参考品的阳性参考品，编号P1 ～ P10；经确证的阴性原料 PB11 ～ PB21 用 TE 缓冲液1 ∶100 稀释作为本套参考品的阴性参考品，编号N1 ～N11，并将TE 缓冲液编号为N12；将已进行CFU 定值的原料 PB2 用 TE 缓冲液 1 ∶83 稀释后作为灵敏度参考品，编号S；将PB2 用TE 缓冲液1∶8 300稀释后作为精密度参考品，编号R。

2.7 百日咳杆菌核酸检测试剂国家参考品协作标定 10 份阳性参考品，除P8 和P10 有1 家企业检出阴性外，其余样本所有试剂均检出阳性，其中P1、P3、P6、P7 和P9 1 家红霉素耐药检测试剂检测为阳性。12 份阴性参考品，除N7 有两家试剂检出阳性外，其余样本所有试剂均检出阴性。精密度参考品所有试剂均检出阳性（包括1 家红霉素耐药检测试剂），其中荧光PCR 法试剂检测结果Ct 值CV 均小于5%。最低检出限参考品对于以IS481 为靶区的试剂，有 1 家试剂 1 × 103cfu ／ mL 及以上浓度检出阳性，其余 1 × 102cfu ／ mL 及以上浓度检出阳性；对于选取启动子和其他保守靶区的试剂，两家试剂1 ×103cfu ／ mL 及以上浓度检出阳性，其余试剂1 ×104cfu ／ mL 及以上浓度检出阳性（包括1 家红霉素耐药检测试剂）。根据协作标定结果，拟定本参考品的标准：12 份阴性参考品应均检出阴性；10 份阳性参考品应均检出阳性，若为百日咳杆菌红霉素耐药位点（23S rRNA A2047G 突变）检测试剂盒，P1、P3、P6、P7 和P9 需检出耐药位点阳性；精密度参考品R重复检测10 次，要求均为百日咳杆菌阳性，且其检测值的CV 应不大于5.0%，若为百日咳杆菌红霉素耐药位点检测试剂盒，重复检测10 次，要求均为耐药位点阳性，且其检测值的CV 不大于5.0%；最低检出限参考品要求对于选择IS481 靶区的试剂，浓度为100cfu ／ mL 及以上时，检测结果应为百日咳杆菌阳性；其他靶区试剂要求浓度为1 × 104cfu ／ mL及以上时，检测结果应为百日咳杆菌阳性，若为百日咳杆菌红霉素耐药位点检测试剂盒，要求浓度为1 ×104cfu ／ mL 及以上时，需检出耐药位点阳性。

2.8 百日咳杆菌核酸检测试剂国家参考品的均匀性 选取百日咳杆菌核酸检测试剂国家参考品中P5、P10、N1 和 R 各 5 支，经检测，P5、P10 和 R 15 次检测结果各Ct 值的CV 分别为0.9%、0.4%和0.6%；N1 均检出阴性，符合要求，表明本套参考品的均匀性良好。

2.9 百日咳杆菌核酸检测试剂国家参考品的稳定性 4 ℃放置5 d、反复冻融3 次处理的最低检出限各梯度稀释样本及精密度样本检测结果的Ct 值和-20 ℃保存的参考品Ct 值的CV 均小于5%，符合要求，表明本套参考品在4 ℃放置5 d 以及反复冻融3次均不影响参考品的稳定性。

3 讨 论

PCR 法是百日咳诊断技术中灵敏度和特异性较高的检测方法，已成为美国疾病预防控制中心实验室确诊标准之一［29］。随着百日咳发病率在全球的上升，近些年国内外越来越多的诊断试剂研发企业投入到百日咳分子诊断的研究中，因此，亟需统一要求对试剂注册标准进行规范，加强该类试剂的监管。

本研究成功建立了百日咳杆菌核酸检测试剂国家参考品，每套参考品含24 支样本，其中阳性参考品10 支，经适当倍数稀释后，模拟临床不同感染阶段菌株浓度不同的情况。临床上百日咳耐药菌株越来越普遍，主要为大环内酯类耐药菌株［27-28］，此次参考品的阳性原料也经23S rRNA 2047 基因扩增测序有5 份为红霉素耐药菌株，与选取的1 家百日咳红霉素耐药检测试剂盒检测结果一致，表明此套参考品可用于百日咳红霉素耐药检测试剂盒的质量控制，但由于市面上百日咳耐药试剂研发尚处于初期阶段，下一步还需增加试剂盒验证数量。此外，近些年全球百日咳发病率上升有许多学者认为与长期免疫压力导致菌株基因发生抗原性改变有关，即非疫苗基因型菌株的流行影响了疫苗对人群的免疫保护力［19-20］。本研究也对参考品中阳性原料的6 个关键抗原位点进行了测序分析，发现prn 有4 种基因型、ptxp 和 ptxA 分别有 3 种基因型、tcfA 有 2 种基因型，但协作标定选取的10 家试剂除1 家试剂有漏检外，其余均能检出百日咳杆菌阳性，表明国内目前的百日咳核酸检测试剂靶标选取合适，不受菌株关键抗原位点基因漂移的影响。阴性参考品12 支，其中除N12 为稀释液外，其余均为与百日咳杆菌感染部位相同、症状相似或可能存在共感染的病原体，用来评价试剂的特异性，经协作标定，结果显示除2 家试剂对N7 支气管炎鲍特菌检出阳性外，其余试剂对所有样本均检出阴性，表明国内目前的百日咳核酸检测试剂特异性良好。分析2 家出现假阳性的试剂，其选择的靶标分别为IS481 和PT 基因启动子区域，原因一方面可能与靶区选择以及引物设计有关，IS481 在支气管炎鲍特菌中有几个拷贝左右，不恰当的引物设计可能对高浓度的支气管炎鲍特菌产生反应性［13，16］，此外，副百日咳杆菌和支气管炎鲍特菌中也存在百日咳毒素假基因序列，对应的百日咳毒素类启动子不启动，因此，选取PT 基因启动子区域为靶区的百日咳核酸检测试剂也有可能与副百日咳杆菌以及支气管炎鲍特菌产生交叉［11］；另一方面，可能与和菌株不纯有关，因此，本研究查阅相关文献设计了百日咳杆菌、副百日咳杆菌、支气管炎鲍特菌的特异性引物以及通用型引物进行扩增鉴别［16-18］，结果显示，本参考品的N6 和N7 为副百日咳杆菌和支气管炎鲍特菌纯菌落，个别试剂检出假阳性，可能与试剂靶区选择以及引物设计有关，导致对高浓度（5.6 × 107cfu ／ mL）的支气管炎鲍特菌产生交叉，提示试剂研发需进行大量鲍特菌属中不同菌株的交叉验证，以提高试剂的特异性。对于检出限和精密度参考品，本研究选取了1 株临床分离耐药株进行培养富集和菌落计数，浓度为 8.3 × 108cfu ／ mL，体积为40 mL，置-80 ℃保存，保证了参考品换批时的连续性和计数稳定性。已知IS481 序列在百日咳杆菌中有50 ～200 个拷贝，平均为单拷贝的PT 基因启动子区域的100 倍左右，因此，对于检出限的标准针对靶区不同分开要求，保证了不同靶区试剂的质量标准一致。

本套参考品的不足之处是未将霍氏鲍特菌纳入其中，主要原因是虽然霍氏鲍特菌在欧美国家陆续有报道，但在中国病例少见，此外，标准菌株的获得较困难，下一步会增加获取途径和方法，计划在参考品换批时加入此菌株。此外，稳定性研究仅进行了短期不同储存条件的比对，运输稳定性和长期稳定性会在接下来的研究中补充和持续评估。最后，本套参考品的检出限参考品计数存在一定的人为误差，但菌株计数目前主要还是依赖培养涂布平板法，其余方法如稀释-比浊法、仪器判读法也都存在一定误差，因此，为了尽量缩小误差，选择将检出限参考品进行大量富集冻存，保证参考品换批时计数的一致性。

本研究通过原料筛选、复核、鉴定、关键抗原位点分析、红霉素耐药位点分析、计数、分组装成套参考品后，经多家试剂协作标定以及均匀性和稳定性研究后制定了本套参考品的质量标准，能够满足国内百日咳核酸检测试剂临床前的质量评估和注册检验工作开展。

志谢感谢首都医科大学附属北京儿童医院北京市儿科研究所姚开虎教授在本研究过程中提供的帮助