气态植物精油对黑曲霉生长及代谢活性的影响

吴红影 王光宇 徐圆程 沈 飞 邱伟芬

(南京财经大学食品科学与工程学院；江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心； 江苏省粮油品质控制及深加工技术重点实验室，南京 210023)

精油是植物体产生的具有芳香气味的次生代谢产物，易挥发，水溶性差，溶于有机溶剂，主要成分为酚类、醇类、醛酮类以及萜类等，可通过蒸馏法、超临界CO2法、冷压法等方法提取，在制药、农艺、食品、化妆品和香水等行业均有应用[1]。近年来，植物精油以其优良的高度挥发性，易降解性和非植物毒性等特点逐渐在各类食品的贮藏保鲜上受到关注[2]。植物精油不仅可以抑制真菌生长，还可以减少毒素积累。如肉桂精油和丁香精油对许多食品腐败微生物有良好的抑制作用，可延长食品货架期[3]。薄荷精油具有抗真菌作用并且可以抑制其产毒，可预防食品在储藏条件下的真菌以及毒素污染[4]。

目前有关精油的研究主要集中在直接接触法，即液态精油的使用，并常用琼脂扩散和稀释法检测液态精油的抗菌活性[5]。在直接接触法中，精油的抑菌效果往往受到活性挥发性物的影响，且液态精油在琼脂培养基中难以扩散，易受到溶剂的影响[6]。越来越多的学者认为，气态精油的抑菌活性可作为确定精油抗菌活性的一种更可靠的指标[7,8]。目前关于气态精油抑菌活性的评估，常用的方法是将浸有精油的滤纸片放置在培养皿盖内表面，根据琼脂表面与盖子之间的空气体积确定精油的浓度，测定其最小抑菌浓度。Lopez等[9]评估了多种气态精油及其主要成分的抑菌活性，降低感官影响的同时延长了食品货架期。Inouye等[10]比较了百里香、肉桂等多种气态精油对不同细菌的抑菌活性，发现肉桂、柠檬草和百里香精油表现出较高的抑菌活性。综合已有研究发现，气态精油可通过影响霉菌生命周期的不同阶段达到抑菌效果，如萌发、菌丝生长和产孢。而气态精油的挥发性化合物导致空气中分生孢子的失活是真菌抑制过程的关键部分。

黑曲霉是稻谷储藏过程中的优势微生物，它的存在对储藏稻谷的品质劣变影响甚大[11-13]。然而目前多数精油防治的研究中所选择菌株不一定具有较强的导致霉变的能力且目前针对精油抑菌的研究多数仍集中在直接接触法，有关气态精油的研究较少。因此，本实验以前期团队分离出的一株具有较强致霉变能力的黑曲霉[14]为研究对象，选取肉桂、丁香、薄荷、茴香、百里香及甜橙6种精油，通过测定气态条件下最小抑菌浓度(MIC)，评估其抑菌效果；随后根据精油对菌丝生长抑制率的影响，确定抑菌率与时间及浓度之间的关系，最后挑选出效果较好的种类验证其对黑曲霉代谢活性以及碳源利用的影响。该研究结果为开发新型、高效、绿色的粮食储藏保鲜技术提供新途径和新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验菌株黑曲霉HY2由本课题组前期从仓储稻谷中分离获得，经通用引物ITS1/ITS4：TCCGTAGGTGAACCTGCGG/TCCTCCGCTTATTGATATGC和钙调蛋白基因CaM引物cmd5/cmd6：CCGAGTACAAGGAGGCCTTC/CCGATAGAGGTCATAACGTGG扩增和测序，鉴定为黑曲霉(Aspergillusniger)，保藏于南京财经大学食品科学与工程学院重点实验室；肉桂精油、丁香精油、薄荷精油、茴香精油、百里香精油、甜橙精油；其他均为分析纯。

1.2 仪器与设备

SF-CF-2A超净工作台，LDZX-50FBS立式压力蒸汽灭菌器，GNP-9160型隔水式恒温培养箱，ELX800酶标仪，BIOLOG ECO平板。

1.3 方法

1.3.1 黑曲霉孢子悬浮液制备

取出预先4 ℃保存的黑曲霉菌株，将其接入PDA 平板培养基中，28 ℃倒置培养5～7 d，待菌丝长势良好至大量产孢。吸取5 mL无菌生理盐水于PDA平板，并用移液器进行吹打，将洗下的孢子悬浮液通过棉花过滤于锥形瓶中，通过血球计数板计数，并用无菌水调整孢子悬浮液浓度至105～106个/mL，置于4 ℃冰箱储存备用。

1.3.2 6种植物精油最小抑菌浓度(MIC)的测定

利用熏蒸法测定气态精油的MIC。取不同量的精油滴于滤纸片上，根据培养皿内空气体积计算，得到不同浓度的精油，不添加精油的处理为空白对照。取10 μL黑曲霉孢子悬浮液滴于培养基中心，滤纸片贴于培养皿盖子中心，将培养皿用封口膜密封，于28 ℃培养3 d。以完全没有菌丝生长的最小浓度作为该气态植物精油MIC。

利用直接接触法测定液态精油的MIC。在无菌条件下，加入5%吐温-20将6种植物精油分别稀释至一定浓度梯度。待已灭菌的PDA培养基冷却，分别吸取各浓度精油稀释液1 mL加入19 mL PDA培养基中，制备成带有不同浓度梯度的植物精油的培养基。空白对照组加1 mL 5%吐温-20，倒入培养基中，静置凝固。在培养基中心打孔，孔径约mol/L，取10 μL黑曲霉孢子悬浮液滴于孔中，于28 ℃培养3 d。以完全没有菌生长的最小浓度作为该液态植物精油MIC。

1.3.3 时间-浓度-抑菌性分析

精油处理同1.3.2中操作，处理完成后将样品于28 ℃培养3 d。3 d后每天记录菌丝生长状况，并且每隔24 h测量一次菌落直径。用十字交叉法测量菌落直径，取其平均值。按公式计算经精油处理后黑曲霉菌丝的生长抑制率：

式中：A1为空白组菌落直径；A2为处理组菌落直径。

1.3.4 代谢活性分析

按照前述操作制备黑曲霉孢子悬浮液，取150 μL黑曲霉孢子悬浮液加至BIOLOG ECO平板的微孔中。将一定量的肉桂精油滴于滤纸片上，根据保鲜盒内体积换算，调整最终体积分数为0.2 μL/mL，以不经精油处理组作为对照。将加有黑曲霉孢子悬浮液的BIOLOG ECO平板放于密封的保鲜盒中，于28 ℃下培养，探究气态精油对黑曲霉代谢活性的影响。每隔2 d取出保鲜盒中的BIOLOG ECO平板，用酶标仪在590 nm(颜色+浊度)和750 nm(浊度)读取数据。测定完成后的平板移出保鲜盒，直接置于培养箱中继续培养，探究暴露于精油中不同时间后黑曲霉代谢活性的变化。每隔2 d用酶标仪在590 nm(颜色+浊度)和750 nm(浊度)读取数据。按公式计算AWCD值：

式中：Ci为不同时刻除对照孔外的各反应孔在590 nm和750 nm下的吸光度差值；R为对照孔在590 nm和750 nm下的吸光度差值；n为碳源数；Ci-R小于0.06的孔计算时记为零[15]。

1.4 数据处理与分析

每组实验重复3 次，采用Excel进行数据分析，使用Origin 9软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同精油的MIC测定

对比直接接触法，采用熏蒸处理方式探究6种精油的抑真菌活性。通过表1数据可知，不同植物精油表现出不同的抑菌性，且差异明显。在熏蒸实验中，肉桂精油的最小抑菌浓度低至0.006 25μL/mL，抑菌效果最好，丁香次之，甜橙最差，而在直接接触实验中，肉桂精油的最小抑菌体积分数为0.1μL/mL。本研究发现在6种精油中，肉桂精油表现出了最强的抑菌效果，同时熏蒸法即气态精油的抑菌效果更强。

表1 不同精油对黑曲霉的MIC

已有大量文献证明液态肉桂精油表现出较好的抑菌效果，其主要活性成分肉桂醛可抑制食品中多种常见污染菌的生长[16]。而甜橙精油抑菌性远远弱于其他精油，有文献报道应用甜橙精油可以有效的抑制黑曲霉和黄曲霉的生长，且抑制效果随着精油浓度的增大而增强[17]，与本研究结果存在差异的原因可能由于目标菌株性质不同。气态精油表现出较强的抑菌性，可能由于霉菌表面生长，更容易受到气相挥发物的影响。另一方面，液态精油中的亲脂分子会形成胶束，影响对微生物的附着，从而影响其抑菌效果[18]。有学者报道了体外研究中液态精油对食源性病原体和腐败微生物的抑菌性[19]，但在食品中达到与体外相同的效果一般需要更高浓度的精油，影响了食品的感官品质。本研究发现气态精油表现出较强的抑菌性，在达到抑菌效果的同时可以减少气味的影响。

2.2 时间-浓度-抑菌性分析

如图1、图2、图3所示，将6种精油根据其抑菌性的强弱分为3组，选择不同浓度梯度，探究抑菌率与时间以及浓度的关系。分析可知，各浓度的气态肉桂精油都表现出100%的抑菌性，气态丁香精油体积分数大于等于0.2 μL/mL时表现出100%的抑菌性，气态薄荷精油体积分数大于等于0.6 μL/mL时抑制率达100%，而气态茴香精油体积分数为2.4μL/mL时表现出对菌丝生长的绝对抑制。虽甜橙精油抑菌效果最弱，但最低浓度的气态精油初始的菌丝生长抑制率达20%以上，明显高于液态精油效果。

图1 肉桂精油和丁香精油的时间-浓度-抑菌性分析

图2 薄荷精油和茴香精油的时间-浓度-抑菌性分析

图3 百里香精油和甜橙精油的时间-浓度-抑菌性分析

因此，气态精油的抑菌性要好于液态精油。随着浓度的增加，6种精油的抑菌率几乎都呈现一定的增大趋势，存在浓度依赖性，这与前人研究一致[20]。但是随着培养时间的增加，较低浓度的精油抑菌率随之减小，抑菌效果逐渐减弱，出现这种现象的原因可能是精油的挥发性较强。

2.3 气态精油处理对黑曲霉整体代谢活性的影响

目前已有多项研究发现，精油处理会影响细胞能量代谢[21]。BIOLOG ECO生态板的AWCD值(Average well color development，平均色度变化率)是一种快速有效反映微生物群落代谢活性，即微生物对碳源的利用能力的方式[22]。通过计算AWCD值探究气态精油对黑曲霉代谢活性的影响，结果表明空白组的AWCD值在第2天之后出现明显的增高，说明黑曲霉开始利用碳源物质进行生长。随后AWCD值的增加速率逐渐变小，趋势平缓，说明黑曲霉的生长达到了稳定期，对于碳源的利用也达到了稳定。与空白组相比，气态肉桂精油处理后的黑曲霉的AWCD值均低于空白组的值，代谢活性降低，表明精油处理后黑曲霉菌体受到一定的影响，对碳源的利用功能受阻。随着时间的增加，精油处理后的AWCD值先增加后降低，说明黑曲霉在气态精油的刺激前期会大量的利用碳源，代谢活性明显升高。随着精油处理时间的延长，代谢受阻，碳源利用能力减弱。

图4反映了暴露在气态肉桂精油中不同时间后黑曲霉AWCD值的变化情况。结果表明，暴露在气态精油中的时间越长，对黑曲霉菌体代谢活性的影响越大。对比空白组的趋势，暴露在气态精油中超过2 d，即使不再受到气态精油胁迫，AWCD值仍逐渐减小，即黑曲霉的碳源利用能力依然呈现下降趋势，表明暴露在气态精油的过程中黑曲霉菌体受到了不可逆的影响，即使精油暴露空中后快速挥发，菌株的代谢能力依旧受到了不可逆的损伤。当黑曲霉仅暴露在气态精油中2 d时，移除精油之后AWCD值逐渐升高，与空白组黑曲霉代谢活性出现相同的趋势，说明在此状态下黑曲霉的代谢活性能够逐渐恢复，未受到不可逆的影响。

图4 肉桂精油处理后AWCD值随时间的变化

2.4 气态精油处理对黑曲霉不同碳源的影响

根据化学官能团、微生物代谢途径和生态功能等，将ECO板的31种碳源底物分为6大类，即碳水化合物，羧酸，氨基酸，多聚物，酚酸类和胺类[23]。通过计算不同碳源的AWCD值，探究暴露在气态精油中的黑曲霉对不同碳源利用能力的影响。结果显示气态肉桂精油对黑曲霉利用6类碳源的能力均产生了不同程度的影响，其中多聚物类，碳水化合物以及酚酸类抑制作用明显，出现此种差异的原因可能是黑曲霉对不同碳源的利用率不同，导致气态精油造成的影响也不同。有研究表明，碳水化合物、多聚类化合物是真菌易于代谢的碳源，天竺葵精油对这两类碳源的利用抑制作用最大[24],与本研究结果一致。相对空白组，气态精油处理后黑曲霉对6类碳源的利用整体呈现下调的趋势，且AWCD值均呈现了先增加后降低的趋势，这与气态精油对黑曲霉菌体的代谢活性抑制结果一致，即黑曲霉在暴露在气态精油中以后，产生的应激反应导致前期大量利用碳源，提高代谢活性，但随着精油处理时间的延长，碳源利用能力减弱，代谢活性下降。

3 结论

使用植物精油作为天然的抑菌药物逐渐成为食品保鲜领域的一种趋势。其高效和环保的特点，能够在保证稻谷和其他食品品质安全的同时，防止真菌污染，从而保证食品的质量和安全。本研究探索了6种气态植物精油的抑菌能力，并挑选出具有强抑菌活性的精油进一步研究对黑曲霉代谢活性的影响。结果表明，气态肉桂精油对黑曲霉分离株具有较强的抑菌效果，同时发现精油处理对黑曲霉菌体的代谢活性，尤其是碳源利用能力产生了一定的影响，且处理时间延长会导致代谢功能的受损不可逆转。