银叶金合欢增殖培养基参数的优化

何冰，潘浩汉，吴建阳，罗威，武爱龙,卜浩，杨丽冬

(湛江幼儿师范专科学校，广东 湛江 524037)

0 引言

相思类树种为含羞草科(Mi-mosaceae)金合欢属(Acacia)植物 ，由于它们具有极大的生态和经济效益而广泛受到人们的喜爱[1]，但来自于我国的相思树种却极少，所以目前我国栽培的相思树种大部分要从澳大利亚引进。相思树能与土壤中的根瘤菌共生固氮而能在氮元素贫瘠、酸性、甚至退化的土壤条件下生存，在我国南方短周期工业原料林发展、水土保持和丰富林木种质资源等方面具有重要作用和地位[2]。银叶金合欢(Acaciapodalyriifolia)就是其中的一种，它具有适应性强，可作荒山造林及营造薪炭林。同时，树形优美，花繁叶茂，花朵金黄色，花期长，是兼具观花和观叶效果的园林绿化和林相改造的优良树种[3-4]。

随着我国园林事业的快速发展，对这些既具有生态价值、经济价值，同时又具有显著观赏价值的观赏相思树的社会需求正在迅速增长，而银叶金合欢的常规繁殖主要有播种和扦插，但由于种子要从国外引进，不仅价格较贵，而且播种条件要求严格、出苗困难，繁殖率极低；扦插繁殖又因枝条内单宁含量较高而生根困难。植物组织培养技术具有繁殖系数大、繁殖周期短、迅速去除病毒、可周年生产等优点, 故组织培养技术的探索成为了国内外学者的研究焦点之一[5]。植物生长调节剂是植物组织培养的关键物质，虽用量极小，但在植物组织培养中起着重要和明显的调节作用[6]，因此组培研究中，对添加植物激素的种类和浓度的研究较为普遍。但传统的组织培养试验是在每个阶段筛选出合适的培养基和培养环境，转接过程可能会造成污染，工作量大，周期长。而响应面法(RSM)采用多元二次回归，将多因子实验中因子指标的相互关系用多项式近似拟合，通过对函数响应面和等高线的分析，能够精确地研究各因子与响应值之间的关系[7]。具有试验数少、周期短、回归方程精度高，并能克服正交试验只能处理离散水平值，而无法找出最佳组合和响应值的缺陷[8]。近几年，响应面法在植物组织培养中逐步得到应用[9-10]。探讨增殖阶段，植物生长调节剂(6-BA、IBA、GA3)对其增殖系数的影响。并在单因素的试验基础上，参考Box-Behnken 设计的中心组合试验设计原理，用响应面法将各因子的相互关系进行拟合分析，研究各因子与响应值的关系，从而优化银叶金合欢的组培条件，为今后相关研究提供理论实践基础。

1 材料与方法

1.1 材料

2018年1月，选择连续晴天3 d以上，从湛江东盟城的东菊公园选择生长健壮、无病虫害的植株，先用酒精消毒后的手术刀将含有腋芽的当年枝条，从其母株上切下，切除枝条上的叶部结构后，用流水冲洗干净，放室内晾3 d。随后，将其放入5%洗洁精溶液中浸泡30 min，软毛刷洗净后流水冲洗30 min，切成长1.0～2.0 cm带腋芽的茎段，在超净工作台上先用75%的酒精消毒1 min，再用0.2% 的升汞(加几滴吐温-20)浸泡消毒20 min，最后用无菌水冲洗5～7次，接于 MS培养基上，获得不定芽。待生长一段时间，剪取不定芽幼嫩茎段，去掉基部叶片，就用此单芽茎段作为实验材料进行离体腋芽增殖培养。

1.2 培养条件

基本培养基为含有30% g/L蔗糖添加量，琼脂粉浓度为6 g/L的MS培养基，附加各种不同比例的激素，pH值为5.8～6.2。组培室培养温度(25±2)℃，培养基均在 121 ℃ 高压灭菌 15 min，光照 12 h/d，光照度 2000 lx。

1.3 试验方法

1.3.1 单因素试验

1.3.1.1 6-BA对增殖系数的影响：将不定芽接种到培养基内，6-BA浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L。每个水平处理5瓶，每瓶接种5株不定芽，重复3次，培养周期为30 d。

1.3.1.2 IBA对增殖系数的影响：将不定芽接种到培养基内，IBA浓度分别为 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L。每个水平处理5瓶，每瓶接种5株不定芽，重复3次，培养周期为30 d。

1.3.1.3 GA3对增殖系数的影响：将不定芽接种到培养基内，GA3浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L。每个水平处理5瓶，每瓶接种5株不定芽，重复3次，培养周期为30 d。

1.3.2 响应面优化试验。在单因素试验的基础上，用响应面分析法，根据Box- Behnken的中心组合试验设计原理，以6-BA、IBA、GA3为试验因子，增殖系数为响应值，进行三因素三水平的优化试验设计，见表1。每个水平处理 10瓶，每瓶接种5株不定芽，培养周期为 30 d。

表1 银叶金合欢增殖培养基响应面试验因素水平mg·L-1

1.4 数据分析

用 SPSS和Design-Expert8.0.6软件对数据进行分析。

增殖系数=培养30 d后有效不定芽总数/接种的不定芽株数。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 6-BA激素浓度对增殖系数的影响。由表2可知，不同6-BA激素浓度对银叶金合欢的增殖影响效果差异极大。随培养基中6-BA 浓度的升高，银叶金合欢的增殖系数也逐渐增加，6-BA浓度达到2.0 mg/L时增殖系数达到最大，为3.21；当 6-BA 浓度增加到 2.5 mg/L 时，银叶金合欢组培苗的增殖系数反而减小，说明6-BA浓度为2.5 mg/L 时银叶金合欢组培苗的增殖生长受到抑制，表明不是6-BA激素浓度越高就越对银叶金合欢组培苗的增殖越好，对连续增殖也存在不利影响，同时6-BA浓度为1.5 mg/L与2.5 mg/L差异不明显。因此，在银叶金合欢组培苗增殖培养中以6-BA 浓度为2.0 mg/L。

表2 增殖培养试验设计与结果 mg·L-1

2.1.2 IBA激素浓度对增殖系数的影响。由表2可知，不同IBA激素浓度对银叶金合欢增殖影响效果不同。各处理的增殖系数高低次序表现为0.40 mg/L>0.50 mg/L>0.30 mg/L>0.20 mg/L>0.10 mg/L。其中， 无菌组培苗在含0.40 mg/L的培养基中增殖系数最大，为2.88，IBA激素浓度为0.1 mg/L增殖系数最低为1.23，但是通过观察发现，IBA激素浓度低的情况下，芽苗长势不错，比较健壮，叶子呈绿色，可能在IBA浓度较低的情况下，有利于芽苗伸长，长大。因此，银叶金合欢增殖培养IBA激素浓度不适合于过高。综合考虑分析，0.40 mg/L为银叶金合欢增殖培养的适宜激素浓度。

2.1.3 GA3对增殖系数的影响。在植物组织培养中，GA3的作用主要用于促进幼苗茎的伸长生长，促进不定胚发育成小植株；赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化有影响，当生长素/赤霉素比值高时有利于木质部分化，比值低时有利于韧皮部分化。所以，很多组培研究中都应用于增殖阶段[11-12]，有利于组培苗增殖分化和生长。不同GA3激素浓度处理的银叶金合欢增殖系数进行多重比较分析。结果表明，不同浓度GA3处理对银叶金合欢增殖系数影响的作用排序为 GA30.20 mg/L>GA30.30 mg/L>GA30.40 mg/L>GA30.50 mg/L>GA30.10 mg/L。差异显著性检测结果显示，GA30.20 mg/L 处理与其它三者处理间的增殖系数差异显著；而GA30.40 mg/L与0.50 mg/L 的增殖系数差异不显著。同时，GA3激素浓度越高越容易导致不定芽之间的抑制作用越强，进而导致丛生芽之间不易生长，因此，在增殖培养基中使用较低的GA3浓度就越好，这个也和很多组培研究人员比较符合[13-14]。因此，在银叶金合欢组培苗增殖培养中以GA3浓度为0.2 mg/L比较合适。

表3 单因素试验结果

2.2 响应面优化结果

2.2.1 回归方程分析。以培养基中6-BA(A)、IBA(B)、GA3(C)为自变量因素，增殖系数(Y)为响应值，根据试验结果得到回归方程为:

Y=2.89+1.49A-0.25B+0.36C+0.21A×B-0.14×A×C-0.28×B×C-0.66×A2-1.14×B2-1.16×C2, 其中, 相关系数R2=0.9914,校正决定系数R2=0.9803。该回归方程的P值<0.0001,有极显著性；方程经失拟性检验分析得F=0.88,P>0.1, 失拟不显著, 表明本实验误差小且方程对试验拟合情况较好。从表4显示, A、BC、A2、B2、C2回归系数极显著(P<0.01)。表明3因素对增殖系数的影响力大小为6-BA>GA3>IBA，其中激素6-BA浓度对银叶金合欢外植体诱导出不定芽有着极显著影响，且6-BA 浓度与GA3浓度的交互作用对诱导出不定芽有显著性影响，但是6-BA浓度与IBA 浓度、GA3浓度的交互作用对结果影响不显著。通过Design-Expert V8.0.6软件得到最优增殖培养基的激素浓度6-BA、IBA和GA3分别为:A=2.00 mg/L,B=0.39 mg/L,C=0.21 mg/L。

表4 响应面二次回归方程方差分析

根据拟合方程，绘制3因素之间交互作用的响应面图和等高线图(如图1)。从响应面的坡度变化及等高线的形状可分析各因素的交互作用: 若等高线的形状为椭圆形表示因素间交互作用显著，圆形则表示因素间交互作用可忽略不计[15]，同时响应面坡度相对平缓表示响应值不敏感; 反之，则敏感。由图1可知，有关6-BA、IBA、GA3的曲面的区别都比较陡峭，也就意味着这3种激素对于增殖的影响比较大，尤其是6-BA、GA3呈现极显著的差异，影响同等大，而IBA呈现显著的差异，影响相对小一点，同时通过通过等高线图及响应面图，可见6-BA与 GA3的交互作用影响力最大，呈现显著的差异。

图1 6-BA、IBA和GA3浓度对银叶金合欢增殖影响的响应面和等高线

2.2.2 最佳激素浓度配比及验证。通过二次回归方程的分析可得出银叶金合欢增殖的最优条件如下：最优增殖培养基的激素浓度6-BA、IBA和GA3分别为:A=2.00 mg/L,B=0.39 mg/L,C=0.21 mg/L。最佳增殖系数预测值为3.75。对该模型进行3次验证试验，为了操作的方便，试验条件如下：6-BA浓度为2.00 mg/L+IBA浓度为4.0 mg/L+GA3浓度为0.20 mg/L。每次处理10株不定芽，获得增殖系数实际平均值为3.73。与预测值十分接近，说明方程与真实试验拟合度较好，该优化方案有实际意义和可行度。

3 讨论与结论

由于银叶金合欢植物具有较高的观赏价值和经济利用价值，在广东、广西以及福建等地得到大面积的推广，种苗需求越来越多，但是目前银叶金合欢在种子繁殖、扦插繁殖种苗方面存在着很多问题，比如萌发或者萌发率较低、难以生根、无法保持亲本的优良性状等等。因此，通过植物组织培养来培育种苗就显得非常重要，称为专家关注的焦点，而在银叶金合欢组织培养中不定芽的增殖培养室基础也是难点。

6-BA可以促进细胞分裂，诱导芽分化，促进侧芽萌发生长，在组织培养中一般用于诱导和增殖培养基中，IBA和6-BA一样，促进诱导愈伤组织的形成，但是2种激素浓度不是越高就越对银叶金合欢组培苗的增殖越好，并对连续增殖也存在不利影响。GA3主要用于促进幼苗茎的伸长生长，促进不定胚发育成小植株，GA3激素浓度越高越容易导致不定芽之间的抑制作用越强，进而导致丛生芽之间不易生长。通过调节这3种激素浓度，能够更好地提高增殖系数。本研究在单因素试验中，6-BA、IBA、GA3的最佳增殖系数分别为 3.32、2.97、2.24。响应面分析法是一种试验次数少、回归方程精度高、能研究多因子间交互作用的研究方法，其高效便捷，可节省人力、成本和时间[16]。优化试验的结果显示，最适合银叶金合欢增殖的培养环境如下：6-BA浓度为2.00 mg/L+IBA浓度为4.0 mg/L+GA3浓度0.20 mg/L，预测增殖系数为3.75。而优化试验中最佳增殖系数为3.73，明显高于单因素的试验结果，说明响应面法用于银叶金合欢组培苗增殖培养条件的优化是可靠的。因此，利用响应面分析法优化银叶金合欢组培苗的增殖培养条件并获得成功，为银叶金合欢组织培养的工厂化育苗提供了一定的理论支撑。