组织中P16、VEGF表达与结肠癌患者临床分期的相关性

余倩倩，童庆红

(潢川县人民医院 病理科，河南 信阳 465150)

手术是治疗结肠癌的重要方式，早期患者可在手术治疗后获得长期生存，而对于中晚期或远处转移患者，也可通过术后化疗延长生存期，挽救患者生命，但不同临床分期患者治疗方法不尽相同，且预后存在一定差异[1]。因此，寻求可有效评估结肠癌患者临床分期的指标有重要意义。目前对于结肠癌临床分期主要采取影像学诊断，但常规影像学诊断有一定滞后性，无法及时反映病灶变化，评估临床分期的价值一般。生物学标志物是评估肿瘤临床分期的重要方式，多肿瘤抑制基因P16是一种蛋白标志物，可抑制多种细胞周期蛋白/细胞周期依赖性蛋白酶复合物的激酶活性，从而抑制细胞生长，与肿瘤发展有关[2]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)属于促血管生成因子，与肿瘤生长、浸润及转移密切相关[3]。由此推测组织中P16、VEGF表达可能与结肠癌患者临床分期相关。鉴于此，本研究着重分析组织中P16、VEGF表达与结肠癌患者临床分期的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2020年5月至2021年5月潢川县人民医院收治的80例结肠癌患者临床资料。80例患者中男47例，女33例；年龄34～60岁，平均(46.60±2.37)岁；肿瘤直径2～7 cm，平均(4.30±0.85)cm；病理类型腺癌64例，腺鳞癌16例。(1)纳入标准：①结肠癌符合《中国结直肠癌预防共识意见》[4]中的诊断标准，并经术后病理诊断检查确诊；②术前未接受放化疗；③在潢川县人民医院完成病理学检查；④临床资料完整。(2)排除标准：①合并其他恶性肿瘤；②同期需行其他手术治疗；③合并免疫功能障碍；④合并血液系统疾病。

1.2 结肠癌患者临床分期评估及分组方法采用肿瘤(tumor node metastasis，TNM)[5]分期标准，0～Ⅰ期为原发肿瘤仅局限于黏膜内或黏膜下层，无淋巴结及远处转移；Ⅱ期为原发肿瘤侵犯肠壁肌层，无淋巴结转移及远处转移；Ⅲ期为无论原发肿瘤侵犯深度，存在区域淋巴结转移，无远处转移；Ⅳ期为肿瘤转移至其他器官，腹腔种植转移，远处淋巴结转移。将0～Ⅰ期患者资料纳入早期组，将Ⅱ期、Ⅲ期患者资料纳入中期组；将Ⅳ期患者资料纳入晚期组。

1.3 组织中P16、VEGF检查方法及阳性判定标准80例患者均在术中取肿瘤组织，常规甲醛固定，石蜡包埋，厚4 μm连续切片，石蜡切片脱水化后，用磷酸盐缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，PBS)浸泡5 min，随后组织抗原微波修复；加内源性过氧化物酶阻滞剂，室温下孵育10 min，然后使用PBS冲洗3次，每次3 min；加封闭用正常山羊血清工作液，室温下孵育20 min，滴加P16、VEGF 1抗，4 ℃冷藏过夜；PBS冲洗3次，每次3 min，加生物素标记的二抗，室温下孵育30 min，PBS冲洗，每次3 min，加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温下孵育30 min，PBS冲洗3次，每次3 min；加过氧化物酶显色底物显色剂，5～10 min，显色完毕，使用苏木素复染，盐酸酒精分化10 s，碳酸锂返蓝10 s，脱水、透明、封片。P16、VEGF阳性标准：采用染色强度结合阳性细胞百分率的半定量积分法判定，P16阳性表达于细胞浆及细胞核，VEGF阳性表达于细胞核及细胞质，于高倍视野(×400)下随机选择5个视野，每个视野计数200个细胞，计算阳性细胞百分率，≤10%(0分)、>10%～25%(1分)、>25%～50%(2分)、>50%～100%(3分)；着色深浅评分，无显色(0分)、浅黄色(1分)、棕黄色(2分)、棕褐色(3分)；两类分数乘积<3分为阴性，否则为阳性。

2 结果

2.1 结肠癌患者临床分期情况80例结肠癌患者中，0～Ⅰ期19例(23.75%)，Ⅱ期24例(30.00%)，Ⅲ期26例(32.50%)，Ⅳ期11例(13.75%)。

2.2 不同临床分期结肠癌患者基线资料中/晚期组组织中P16阴性表达、VEGF阳性表达患者占比高于早期组，差异有统计学意义(P<0.05)；中期组、晚期组组织中P16、VEGF表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)；不同临床分期患者其他基线资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 不同临床分期结肠癌患者基线资料比较

2.3 组织中P16、VEGF表达与结肠癌患者临床分期的相关性分析将结肠癌患者临床分期作为因变量(“1”=中/晚期，“0”=早期)，并将表1中经比较差异有统计学意义的变量(组织中P16表达、组织中VEGF表达)纳入作为自变量(赋值情况见表2)，进行logistic回归分析，结果显示，组织中P16阴性表达、VEGF阳性表达与结肠癌患者临床高分期有关(OR>1，P<0.05)。见表3。

表2 变量赋值说明

表3 组织中P16、VEGF表达与结肠癌患者临床分期的相关性分析

3 讨论

以手术为主的综合方案是目前治疗结肠癌的重要手段，早期结肠癌患者经上述方案治疗后生存率得到显著提高，预后较好；但中晚期患者肿瘤侵犯淋巴结及周围组织，在一定程度上增加治疗难度，术后易复发，导致不良预后[6]。本研究结果显示，80例结肠癌患者中，中晚期患者61例，占比76.25%。可见，结肠癌患者确诊时往往为中晚期，因此，明确患者临床分期对患者治疗方案的拟定十分必要。

P16基因是一种细胞周期中的基本基因，直接参与细胞周期的调控，可负调节细胞增殖及分裂，对抑制肿瘤生长有重要意义[7]。VEGF可通过与内皮细胞表面特异性受体相结合，参与调解肿瘤细胞的增殖，诱导血管生成，为肿瘤生长提供营养[8]。由此推测组织中P16、VEGF可能与结肠癌临床分期相关。本研究结果显示，中、晚期组组织中P16阴性表达、VEGF阳性表达患者占比高于早期组，并经logistic回归分析，结果显示，组织中P16阴性表达、VEGF阳性表达与结肠癌患者临床分期密切相关，表明组织中P16阴性表达、VEGF阳性表达与结肠癌患者临床高分期相关。分析其原因在于，P16基因是重要的抑癌基因，其编码产物P16蛋白可通过与周期蛋白依赖性激酶4(cyclin-dependent protein kinases 4，CDK4)相结合，调控CDK4/周期蛋白的D复合产物的催化活性，进而抑制肿瘤细胞增殖，控制其恶性程度[9]。但当P16基因缺失或P16蛋白低表达，使细胞增殖程序失控，从而促进肿瘤细胞生长，同时缺失P16蛋白还可导致细胞间黏附力下降，使肿瘤更容易发生转移，导致临床分期升高。因此，组织中P16阴性表达与结肠癌患者临床分期密切相关。肿瘤侵袭及转移过程涉及多种因素，其中血管生成是重要因素。VEGF可通过与其特异性受体相结合，使受体自身磷酸化，激活细胞内信号传导通路，促使血管内皮细胞增殖、分裂，诱导新生血管生成并增加血管通透性，为肿瘤生长及侵袭提供营养物质，从而导致结肠癌患者临床分期升高[10]。

综上所述，组织中P16阴性表达、VEGF阳性表达与结肠癌患者临床高分期存在一定联系，未来临床可通过检测患者组织中P16、VEGF表达情况，评估患者临床分期。