基于3D QSAR技术从毛冬青中筛选NF-кB小分子抑制剂

李 璐，田人魁，吴钉红

(广州中医药大学第二临床医院，广东 广州 510120)

NF-кB(Nuclear factor kappa B)是一种细胞内重要的核转录因子，在大多数细胞类型中普遍表达，参与调节了免疫细胞的活化、细胞凋亡等多种细胞活动，是免疫和炎症通路中极为重要的转录因子。NF-кB在膝骨关节炎(KOA)[1]、过敏性鼻炎[2]、哮喘[3]等各种炎症性疾病的发生发展过程中扮演着重要角色，而在一些常见的妇科炎症性疾病的病理过程中，同样离不开NF-кB的参与。研究表明，慢性盆腔炎[4]、子宫内膜炎[5]、需氧菌性阴道炎[6]、慢性输卵管炎[7]、外阴阴道假丝酵母菌病(Vulvovaginal candidiasis, VVC)[8]等妇科炎症性疾病的发病机制与NF-кB密切相关。NF-кB可通过调节趋化因子、粘附因子、细胞因子、酶及凋亡基因的表达，调控细胞粘附、侵袭、血管生成及凋亡, 病变组织产生的促炎细胞因子和趋化因子依赖于NF-кB,因此长期以来NF-кB都被当作新型抗炎药物的靶点，而发展NF-kB抑制剂，也有利于在临床应用中挖掘更有效的治疗方案。

本院针对盆腔炎开发了多种以毛冬青为主药的中药复方院内制剂，临床疗效良好，我们推测毛冬青可能具有较好的抗炎作用，甚至具有抑制NF-κB的活性。但是目前尚未对其活性进行深入的研究。三维定量构效关系(3D-QSAR)是一种独立可靠的药物设计工具，通过对分子三维结构信息进行定量构效关系研究，为进一步的药物开发提供指导。

因此，本研究通过计算机方法建立NF-кB的3D-QSAR药效团模型，运用建立的药效团对毛冬青中所含的76个小分子化合物的抗NF-кB活性进行预测分析，从中筛选可能具有抑制NF-кB活性的小分子化合物，为毛冬青制剂在临床更好地应用提供实验支持，并为进一步的研究奠定基础。

1 实 验

1.1 数据集的建立

从文献中收集20个具有抗NF-кB活性的小分子化合物。其中13个化合物作为训练集，包括雷公藤甲素(T5)[9-10]，羟基苯甲酰-3,4-二氢喹喔啉类化合物4个(T1-T4)[11]，苯基哌嗪类化合物1个(T6)[12]，黄酮类化合物4个(T7-T10)[13]，苯并-γ-吡喃酮类化合物3个(T11-T13)[14]。选择7个化合物建立测试集，包括羟基苯甲酰-3,4-二氢喹喔啉类化合物3个(E1-3)[11]，黄酮类化合物3个(E4-6)[13]，苯并-γ-吡喃酮类化合物1个(E7)[14]，见图1。训练集和测试集按照随机和活性梯度原则选取，所有化合物活性均以IC50值表示。从Reaxys(https://www.reaxys.com/)数据库和文献中收集毛冬青小分子化学成分共76个。

图1 训练集和测试集化合物分子结构T1-T13为训练集，E1-E7为测试集

1.2 NF-кB 的3D QSAR药效团模型的构建与毛冬青中活性小分子的筛选

将训练集分子三维结构导入Discovery Studio(2.5 version)。先用Generate Conformation Protocol 模块进行多构象生成，构象产生方法设为“FAST”，其它参数均为默认。然后使用3D QSAR Pharmacophore Generation Protocol 模块构建NF-кB 的3D QSAR药效团模型，根据训练集分子的结构特征，选择HB_ACCEPTOR 0 5, HB_DONOR 0 5，HYDROPHOBIC 0 5, RING_AROMATIC 0 5四个参数作为需考虑的药效特征元素，其它参数均使用默认值。

测试集与训练集通过Discovery Studio的Build 3D Database 模块产生构象建立数据库，参数为默认。通过Search 3D Database模块，导入测试集分子的构象，对药效团的活性预测能力进行测试，实验值与预测值之间的标准偏差较小、相关系数较大的药效团，可认为该药效团预测能力较好。最后选择预测能力最好的1个药效团，对毛冬青中76个小分子化合物抗NF-кB活性进行预测，其它参数为默认。

2 结 果

2.1 构建的NF-кB药效团模型具有较好的预测能力

经过计算得到10个药效团模型，见表1。其中药效团1包括1个氢键受体(HBA)，2个疏水基团(HYDROPHOBIC)，1个环(RING)，1个芳香键(AROMATIC)；Totalcost为57.5692，使用该药效团对训练集的13个化合物进行活性预测，预测值与实验值之间的标准偏差(RMS)为0.3974，相关系数R为0.9614，表明实验值与预测值相关性良好，Config值为12.5519，表明该药效团具有较好的预测能力，并且预测结果基本可信，见图2。应用7个化合物组成的测试集对该药效团的预测能力进行进一步的检测，实验值与预测值的相关性良好，r2为0.9414，见图3。训练集和测试集的试验活性和预测活性数据见表3。

图2 测试集实验值与预测值线性关系图

表1 十个药效团预测结果表

表2 训练集和测试集化合物试验活性及预测活性表

2.2 从毛冬青中筛选出4个潜在的NF-кB小分子抑制剂

运用建立的药效团模型对毛冬青中76个小分子化合物抗NF-кB活性进行预测，筛选出4个具有潜在活性的小分子化合物，包括美商陆皂苷B(Phytolaccoside B)，冬青苷A(Ilexoside A)，异绿原酸A(3,5-dicaffeoylquinic acid)，Sibiricaphenone，IC50值分别为15.99 μM、6.45 μM，15.68 μM和8.06 μM，见表3。图3为毛冬青中潜在的4个NF-κB小分子抑制剂与药效团的叠合图，均有3个以上的基团能与药效团相叠合。图4为4个小分子化合物的化学结构图。

表3 毛冬青中潜在NF-κB抑制剂名称及预测活性

图3 毛冬青中潜在NF-κB抑制剂与药效团叠合图

图4 毛冬青中潜在活性成分分子结构图

3 讨 论

本研究基于13个化合物建立了十个NF-кB的3D-QSAR模型，其中药效团1包括一个氢键受体，两个疏水基团，一个芳香基团，Totalcost为57.569，相关系数R为0.989，Config值为12.129，利用该药效团对测试集进行预测，预测值与实验值的r2为0.9414。应用7个化合物组成的测试集对该药效团的预测能力进行进一步的检测，r2为0.9414，表明建立的药效团具有良好的预测能力。运用建立的药效团对毛冬青中所含的76个小分子化合物的抗NF-кB活性进行预测分析，从中筛选出4个可能具有较好活性小分子化合物，美商陆皂苷B(Phytolaccoside B)，冬青苷A(Ilexoside A)，异绿原酸A(3,5-dicaffeoylquinic acid)和Sibiricaphenone。已知NF-кB抑制剂柳氮磺胺吡啶的活性为50.7061 μM，而从毛冬青的化学成分中筛选出的4个药物预测的IC50值在6.45～15.99 μM之间，预测活性数据良好，但是否能作用于NF-кB，还需要进一步的实验验证。

毛冬青是一种在中国南方地区广泛分布的中药材，为冬青科植物毛冬青的根或叶，功效为清热解毒，活血通脉。因其具有良好的抗炎作用，毛冬青在临床中被用于消除慢性心力衰竭的炎症状态[15]，缓解膝关节镜术后早期关节肿痛与炎症[16]，以及慢性盆腔炎[17-18]等炎症性疾病的治疗中。以往对毛冬青中抗炎化学成分的研究认为，毛冬青甲素可通过促进增生性炎症的转化与吸收，降低血液粘度来发挥其抗炎作用[19-20]；毛冬青乙素可以抑制炎症早期的毛细血管通透性增加和急性炎症的渗出、水肿，同时可降低大鼠肾上腺的VitC含量，因而毛冬青乙素可能是通过垂体肾上腺皮质系统而发挥其部分抗炎作用[21]。关于毛冬青与NF-κB之间的联系，已有研究表明[22]，用毛冬青提取液对慢性心力衰竭模型大鼠灌胃，可明显降低NF-κB的表达。Escalante A等[23]研究发现美商陆皂苷B(Phytolaccoside B)具有抗真菌活性，可使霉菌和酵母菌产生畸形，但并不引起红细胞溶血，有可能用于真菌感染的治疗。刘杨等[24]通过实验证实异绿原酸A(3,5-dicaffeoylquinic acid)在胶原诱导型关节炎大鼠模型中，能明显抑制NLRP3炎性复合体在关节滑膜内的表达，并能明显抑制关节滑膜内NF-κB 蛋白表达及其磷酸化水平，同时可抑制 NF-κB 抑制蛋白ɑ亚基的磷酸化水平，从而减轻相关的炎症反应。付运星[25]发现异绿原酸A可显著下调感染犬瘟热病毒(CDV)的狗肾细胞(MDCK)中IL-Iβ、IL-6、TNF-α、TLR3基因转录水平，证实异绿原酸A可以通过影响TLR3信号通路发挥其抗炎作用。侯彩平等[26]发现异绿原酸A在硫酸铜诱导的斑马鱼炎症模型中可使斑马鱼体内测线巨噬细胞数减少，且减少数量与异绿原酸A的浓度呈正相关，表明异绿原酸A有良好的抗炎活性。笔者对冬青苷A(Ilexoside A)和Sibiricaphenone两种分子未查找到其相关药理作用的研究。

4 结 论

根据现有研究资料，本研究筛选出的4个分子中，异绿原酸A(3,5-dicaffeoylquinic acid)有良好的抗炎活性，抗NF-кB作用显著，可能成为NF-kB抑制药物。美商陆皂苷B(Phytolaccoside B)、冬青苷A(Ilexoside A)、Sibiricaphenone等三个分子则有待进一步的研究，以验证其与炎症和NF-кB的联系。中医药是伟大的宝库，前人对中药功效的总结来源于临床实践，是直接从大量人体实验中得出的宝贵结论，后人将其应用于临床往往行之有效，而其背后的药物作用机制则有待我们进行深入研究，从中医药治疗经验中找寻新的药物显然是规避药物开发风险的一种有效手段。正如日本汉医学家汤本求真在其著作《皇汉医学》中所言：“乃知此学虽旧，苟能抉其蕴奥而活用之，胜于今日之新法多矣。”从大量中医药实际诊疗经验中发现可能含有有效作用成分的药物，再结合计算机辅助药物筛选初步筛选出活性成分，可以大幅缩小实验范围，节省大量的人力物力，缩短研究周期，降低研究风险，这种研究方法用于药物开发的起始阶段已经得到广泛的认可。