白芷免洗面膜的制备及质量评价*

杨红梅，刘玲玲，何明城，江 政，莫思敏，唐慧艳，曽妍芸

(梧州学院，广西六堡茶种质创新与综合利用工程研究中心，广西 梧州 543002)

白芷以根入药，始载于《神农本草经》，列为中品，有悠久的药用历史。白芷还具有保湿、美白等作用，在美容护肤方面被广泛应用。白芷中主含香豆素类、挥发油类、脂肪酸类等化合物, 其中香豆素类化合物是白芷的主要活性成分, 包括欧前胡素、异欧前胡素等[1]。现代药理学研究表明, 白芷中香豆素类化合物不仅具有解热镇痛、抗炎、抗高血压、抗凝血、抗微生物等药理活性[2]，而且可通过抑制酪氨酸酶活性，抑制黑色素形成而具有显著的美白作用[3]。

本研究通过对白芷中香豆素类物质的提取工艺研究，优化出最佳的工艺条件，以此条件获得白芷提取物。通过对白芷面膜基质处方的筛选，获得面膜基质处方。制备白芷面膜并对其进行质量检查和酪氨酸酶抑制率的测定，通过检查此面膜在外观性状、有效成分含量、物理性状、刺激性、稳定性等方面符合免洗面膜的质量要求，并对络氨酸酶有明显的抑制作用。通过现代技术提取白芷的有效成分制备免洗面膜，与传统面膜相比，具有安全、有效、方便等优势。

1 仪器与材料

1.1 仪 器

103型高速中药粉碎机，瑞安永历制药机械有限公司；Agilent 1260液相色谱仪，美国安捷伦科技有限公司；Agilene紫外检测器；XA205DU型电子天平，梅特勒-托利多仪器上海有限公司；EV311-V型旋转蒸发仪，LabTech仪器厂；KM-1990QFY数控超声仪； CX41生物显微镜，日本奥林巴斯；RM2255莱卡全自动切片机，Leica公司；752N紫外分光光度计。

1.2 材 料

禹白芷，梧州市食品药品检验所提供(批号20200802)；欧前胡素和异欧前胡素对照品，中国食品药品检定研究院；羊毛脂(20190515)，天津百伦斯生物技术有限公司；甲醇(色谱纯)，美国Sigma公司；液体石蜡(20191104)，广东光华科技股份有限公司；二甲基硅油(200109)，西陇科学股份有限公司；吐温-60(089798005200)，广州润华；司盘-60(089906002120)，临沂绿森；甘油(20190114)，广东光华科技股份有限公司；山梨酸(20200508)，江苏佰业生物科技有限公司；L-酪氨酸(20200902)，上海蓝季生物；茉莉香精(089598003020)，山东优索化工科技有限公司；甲醇、乙醇、均为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 欧前胡素和异欧前胡素分析方法建立

2.1.1 色谱条件[4]

色谱柱为Agilent Eclipse XDB C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流动相为甲醇-水(59:41)；流速1.0 mL/min；波长248 nm，柱温30℃；进样量 10 μL。

2.1.2 标准曲线的测定

分别精密称取欧前胡素标准品(0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06 mg/mL)，按“2.1.1”色谱条件进样，以欧前胡素标准品质量为横坐标X(μg)，峰面积为纵坐标Y(mAU)，得到线性回归方程为：Y=2669.17X+8.801，R2=0.999，并在0.10～0.60 μg 范围内呈良好的线性关系。

分别精密称取异欧前胡素标准品(0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06 mg/mL)，按“2.1.1”色谱条件进样，以异欧前胡素标准品质量为横坐标X(μg)，峰面积为纵坐标Y(mAU)，得到线性回归方程为：Y=5601.39X+1.452，R2=0.997，并在0.10～0.60 μg 范围内呈良好的线性关系。线性关系如图1。

图1 HPLC法欧前胡素和异欧前胡素线性图

2.1.3 分析误差校验

以欧前胡素为线索，精密度实验欧前胡素RSD为0.8% (n=6)；待测液稳定性实验RSD为1.5%(24 h内，n=6)；重复性试验RSD为1.4%(n=6)；加样回收实验平均回收率为99.91%(RSD=0.1%)(n=6)。

2.2 欧前胡素和异欧前胡素的提取方法和条件

选用超声辅助提取方法，选择主要影响因素料液比、提取时间和提取温度等3因素进行正交试验。按“2.1.1”色谱条件进样，以欧前胡素和异欧前胡素得率为指标，考察提取欧前胡素和异欧前胡素的最佳工艺条件。正交试验因素水平如表1所示。

表1 超声提取欧前胡素和异欧前胡素工艺L9(34)正交试验因素水平表

由于提取溶剂对白芷美白效果有一定的影响,并且水提液效果更好[5]。参照中国药典[6]，按下述方法提取：取本品细粉 4 g 精密称定，置量瓶中，加水，超声处理(功率 300 W ，频率 50 kH z)l h取出冷却，加水至刻度，滤过，取续滤液，滤液用高效液相色谱在300 nm处测定欧前胡素和异欧前胡素含量。

2.3 面膜基质处方的筛选

2.3.1 面膜基质成分组成

免洗面膜的基质按照护肤霜的基质制备。护肤霜基质包括油脂性、水溶性、乳剂型三大类，其中乳剂型根据其亲水亲油性不同又分为水包油型(O/W型)和油包水型(W/O型)两类。不同类型基质的渗透性、理化性质、物质释放度不同，研究发现，基质渗透性的大小关系为：乳剂型基质>水溶性基质>油脂型基质[7]，而乳剂型基质中，O/W型基质更易于涂布，油腻感小，粘性小，易清洗，故选O/W型乳剂基质为面膜基质。水包油型乳剂型基质除了油相、水相、乳化剂外，还需加入保湿剂和防腐剂，其基本组成见表2。

表2 面膜基质的成分组成

2.3.2 面膜基质处方设计

按处方中油相、水相、乳化剂等的组成比例不同，分别制备A、B、C三种面膜基质。

油相:经预实验确定油相中羊毛脂、液体石蜡的含量分别为20%、8%，以二甲基硅油的含量为自变量，分别为8%、8.5%、9%。

乳化剂:制备O/W型面膜基质，乳化剂的亲水亲油平衡值(HLB)应在8～18之间，乳化液体石蜡所需的HLB要求在10～12之间，非离子表面活性剂的HLB具有加和性，所以司盘-60和吐温-60混合后的HLB按以下公式计算：

并且选择乳化剂时，主要乳化剂HLB值应大于6(吐温-60,HLB=14.9)，辅助乳化剂HLB值应小于6(司盘-40, HLB=4.7)。乳化剂的用量一般占油相重量和乳化剂重量和的10%～20%，如果乳化剂含量为7%时，A、B、C 三种面膜基质的油相组成、乳化剂组成、乳化剂占比及HLB见表3。

表3 A、B、C 三种面膜基质的油相组成、乳化剂组成、乳化剂占比及HLB

水相：甘油为保湿剂，占基质重量比为5%，其余为蒸馏水，香精、防腐剂(山梨酸)适量。

2.3.3 面膜基质制备和基质处方确定

按面膜基质的处方组成将油相、水相分别混合置于烧杯中，于90 ℃恒温水浴中，同一方向搅拌20 min，缓慢把水相加入到油相中，混匀，继续在90℃水浴中，同一方向搅拌 20 min，取出，冷却，得到面膜基质A、B、C。

对A、B、C三种面膜基质分别进行感官性能评价、高温试验、低温试验、酸碱度测定、离心试验、成膜试验、面膜基质颗粒均匀度的显微观察等，根据检测结果筛选出最佳的基质处方。检测项目、内容及评价分值如表4所示。

表4 A、B、C三种基质的检测项目、内容及所占分值

2.4 面膜的制备和质量评价

2.4.1 面膜的制备

按实验步骤“2.3.3”筛选出的基质处方制备面膜基质。

按实验步骤“2.2”超声法提取欧前胡素和异欧前胡素得到的最佳工艺条件，制备白芷提取液，蒸发浓缩，得到白芷提取物，低温保存备用。

将白芷提取物加入面膜基质中，搅拌混匀，加入灭菌容器中，密封保存。

2.4.2 面膜的质量评价

2.4.2.1 质量检查

面膜质量检查内容和方法如表5所示。

表5 面膜质量检查内容和方法

2.4.2.2 酪氨酸酶抑制率的测定

(1)精密称取10 mg的L-酪氨酸于10 mL容量瓶中，用pH为6.8的缓冲液定容，即得1.0 mg/mL的L-酪氨酸溶液。

(2)0.1 mg/mL酪氨酸酶溶液的制备[8]：

取12.5 g冰冻碎土豆于预冷的研钵中，加入25 mL冰冷的pH为6.8的缓冲液，研磨1 min，过滤，立即把滤液装入离心管中，在4000 r·min-1离心机中离心5 min。取上清液装入离心管，得到酪氨酸酶。密封保存在3 ℃的冰箱中，备用。

精密称取2.5 mg的酪氨酸酶置于25 mL容量瓶中，用pH为6.8的缓冲液定容，即得0.1 mg/mL酪氨酸酶溶液。

(3)分别在6支试管(样1、样2、样3、样4、样5、样6)中加入表6待测液成分并测定吸光度[9-10]。

表6 待测液的组成

分别将表6各试管中待测液混匀，置于37 ℃恒温水浴 10 min，立即于475 nm处测吸光度，并记录。按以下公式计算面膜的酪氨酸酶抑制率。

每个样品测试5次，取平均值。

3 结果与讨论

3.1 欧前胡素和异欧前胡素提取工艺

按实验步骤“2.2”考察超声法提取欧前胡素和异欧前胡素的最佳工艺条件，按照表1正交试验因素水平进行L9(34)正交试验，结果如表7所示。

表7 超声提取欧前胡素和异欧前胡素工艺L9(34)正交试验结果

根据极差值K1、K2、K3及R值分析，提取料液比、提取时间和提取温度对香豆素提取率均有影响，各个因素对结果的影响程度为：料液比(A)>提取温度(C)>提取时间(B)，其中料液比对结果影响最大。结合欧前胡素和异欧前胡素得率分析，可以得到各因素较优的水平组合为A2B1C3。而C3为该因素考察的最大值，并且温度对结果影响较大，所以对最优条件组合还需进一步考察，即采用提取温度100 ℃、料液比1:10、提取时间1 h进行超声提取(同时完成3个样品)，得到欧前胡素和异欧前胡素和的平均含量为7.30 mg/g。结果说明，在其他条件不变的情况下，提取温度升高，欧前胡素和异欧前胡素得率并没有增大，可能是温度升高对欧前胡素和异欧前胡素的降解有影响。综合分析，超声法提取白芷中欧前胡素和异欧前胡素的最优化条件为A2B1C3，即以水为提取溶剂，料液比1:10,在温度80 ℃的条件下提取1 h。

3.2 面膜基质处方的筛选结果

依据步骤“2.3.1”确定面膜基质的类型为水包油型乳剂型基质，基本组成为：羊毛脂、液体石蜡、二甲基硅油、甘油、蒸馏水、吐温-60、司盘-60、山梨酸。按步骤“2.3.2”确定A、B、C三个基质处方的组成。按步骤“2.3.3”制备A、B、C三种基质，并对其进行检测，结果见表8。

表8 A、B、C三种面膜基质的检测结果

依据以上检测结果，三种基质中A型最佳，故面膜基质的处方按A型确定，即为：羊毛脂20%、液体石蜡8%、二甲基硅油8%、司盘-60 2.6%、吐温-60 4.4%、甘油5%、香精适量、山梨酸适量、蒸馏水48%。

3.3 面膜的制备和质量评价

3.3.1 面膜的制备

面膜基质制备。面膜基质选择A型基质处方，按步骤“2.4.1”制备面膜基质约195 g，即羊毛脂40 g、液体石蜡 16 g、二甲基硅油16 g、司盘-605.2 g、吐温-608.8 g、甘油10 g、香精适量、山梨酸适量、蒸馏水96 g。

白芷提取物制备。白芷原粉用于美白护肤时，每次用量约为6 g。本面膜单位包装约200 g，预计使用100次，即白芷药材总量约需600 g，考虑到提取、制备等过程中的损失，故提取时取白芷药材650 g，按结果“3.1”的工艺条件，即以水为提取溶剂，料液比1：10,在温度80 ℃的条件下提取1 h，浓缩干燥。

按步骤“2.4.1”制备白芷面膜。

3.3.2 面膜的质量评价

3.3.2.1 质量检查结果

按步骤“2.4.2.1”对面膜进行质量检查，结果如表9所示。

表9 面膜质量检查结果

根据以上各项结果，此面膜符合免洗面膜的质量要求。

3.3.2.2 酪氨酸酶抑制率结果

按步骤“2.4.2.2”测定面膜的酪氨酸酶抑制率，考察白芷面膜的美白特性，结果如表10所示。

表10 面膜的酪氨酸酶抑制率

从以上结果可知，6个样品对络氨酸酶都有抑制作用，其中未加入面膜和面膜基质的样品1和样品2络氨酸酶抑制率最低；加入面膜而未加入面膜基质的样品3和样品4络氨酸酶抑制率最高；加入面膜基质而未加入面膜的样品5和样品6络氨酸酶抑制率介于两者之间，结果更接近于样品1和样品2。说明面膜中白芷提取物对络氨酸酶有明显的抑制作用，且缓冲液、络氨酸酶溶液、L-络氨酸溶液及面膜的比例在5:1:1:1时抑制率最高。

4 结 论

(1)以水为溶剂超声法提取白芷中欧前胡素和异欧前胡素的最优条件为：料液比1:10，在温度80 ℃的条件下提取1 h。

(2)白芷面膜基质的处方组成为：羊毛脂20%、液体石蜡8%、二甲基硅油8%、司盘-60 2.6%、吐温-60 4.4%、甘油5%、香精适量、山梨酸适量、蒸馏水48%。

(3)白芷面膜对络氨酸酶有明显的抑制作用，且质量检查符合免洗面膜的各项标准。