微红梢斑螟诱导马尾松挥发物成分变化及其行为反应

谢云忠，王国伟，刘江桥，徐芳玲

(贵州大学林学院，贵州 贵阳 550025)

微红梢斑螟DioryctriarubellaHampson隶属于属鳞翅目Lepidoptera螟蛾科Pyralidae斑螟亚科Phycitinae梢斑螟属Dioryctria[1]。在国内大多数省市有分布；国外主要分布于欧洲，俄罗斯、日本、朝鲜等。寄主主要有马尾松Pinusmassoniana、黑松P.thunbergii、火炬松P.taeda等18种针叶树种[2]。微红梢斑螟为梢果兼害型害虫，因其主要蛀食幼树主梢和侧梢，往往引起树木偏冠和多头现象，严重影响松树生长势、干型和出材量[3]。幼虫可蛀食成熟林球果，影响到松树种子产量以及天然更新速度。近年来，微红梢斑螟已逐步上升成为我国南方地区松树重要害虫之一，如2009年湖南微红梢斑螟严重暴发，危害面积达17.7万hm2[4]。

针叶树不同组织产生的挥发性物质组成不同，且某些组织具有特异性成分，这些特异性成分为昆虫在寄主上定向活动(产卵、逃避和取食等)发挥着引导作用[5-7]。植物挥发物随着害虫取食，其部分成分和含量会发生变化，并对昆虫表现出引诱或者趋避作用。有研究表明二化螟Chilosuppressalis取食为害水稻后，诱导水稻植株产生的挥发物显著驱避二化螟成虫产卵[8]，但是趋性产卵于褐飞虱NilaparvatalugensStål为害或者褐飞虱和二化螟共同为害的水稻植株[9]。李新岗 等研究发现松果梢斑螟DioryctriamendacellaStaudinger选择虫害油松Pinustabuliformis球果而不选择健康油松球果[10]。为了明确其中的选择原因，杨立军对虫害油松果和健康油松果挥发物成分进行对比分析，发现虫害球果所释放的挥发物组分和含量发生了较大的变化，其中变化比较明显的组分有α-蒎烯、β-蒎烯、β-香叶烯等，且松果梢斑螟对β-香叶烯、D-柠檬烯、α-蒎烯等具有显著的触角电位(EAG)反应[11]。说明球果挥发物主要成分和含量对松果梢斑螟具有明显引诱作用。美国南方松梢斑螟Dioryctriaamatella明显趋向于在东南球果锈病菌Cronartiumstrobilinum为害的2 a生球果上产卵，寄主引诱成分为α-蒎烯、香叶烯和柠檬烯[12-14]。因此，虫害诱导植物挥发物的种类和含量等均是调控植食性昆虫取食和产卵行为的关键因素之一。笔者分析微红梢斑螟取食诱导后的马尾松松果和松梢挥发物变化，观察其嗅觉行为反应，以期为后续微红梢斑螟监测和引诱剂的研发提供理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1供试虫源 微红梢斑螟幼虫均采自贵州省都匀市马鞍山马尾松国家林木良种基地和贵州省凯里市黄平县国有林场。采集后，人工饲养于透明保鲜盒中，以新鲜松梢为食料，每7 d更换食料，每天对食料表面喷雾保湿，置于人工气候箱(温度26 ℃、相对湿度60%、光周期14 L∶10 D)中饲养。

1.2松梢和松果浸提液的制备 称取微红梢斑螟虫害松梢和健康松梢各20 g，虫害松果和健康松果各45 g，松梢用20 mL正己烷，松果用45 mL正己烷浸提24 h，过滤后置于-18 ℃下保存备用[15-16]。

1.3挥发物的收集与鉴定 在都匀市马鞍山马尾松国家林木良种基地采用动态顶空吸附法对马尾松挥发物进行活体采集。采集时将虫害和健康松梢、松果分别套入微波炉专用袋(Oven bags，25 cm×38 cm，美国Reynolds公司)中密封。收集前先排净袋内空气，然后通入经过活性炭过滤过的干燥空气，待袋内充满空气为止。QC-1S大气采样仪(北京市劳动保护科学研究院)进气口和出气口分别连接活性炭管和吸附管(填充有Porapak Q吸附剂，80～100目，北京康林科技有限责任公司)，其余用硅胶管相连，并在接口处用封口膜封住，避免漏气。大气采样仪的流速设定为0.5 L/min，采集时间为6 h，试验重复5次。收集完成后立即用封口膜将吸附管两侧封堵，带回实验室用2 mL正己烷洗脱，置于-18 ℃冰箱保存待分析。

采用HP6890/5975C GC/MS联用仪(美国安捷伦公司)对挥发物洗脱液进行分析。色谱柱为HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)弹性石英毛细管柱，柱温40 ℃，保持2 min，以4 ℃/min升温至220 ℃，保持19 min，运行时间66 min；汽化室温度230 ℃；载气为高纯He(99.999%)；载气流量1.0 mL/min；分流进样，分流比10∶1；溶剂延迟时间3 min。离子源为EI源，离子源温度230 ℃，电子能量70 eV，发射电流34.6 μA，倍增器电压1 776 V，接口温度240 ℃，质量范围29～500 amu。

1.4微红梢斑螟对梢果4种浸提液的嗅觉行为反应 采用“Y”形嗅觉仪(直臂长20 cm，两侧臂长15 cm，内径4 cm)测试微红梢斑螟对虫害和健康松梢、松果4种浸提液的嗅觉行为反应。测试前于味源瓶中滴入30 μL待测浸提液，以正己烷为对照，气流速率调节500 mL/min。在主臂一端放入1头微红梢斑螟成虫，每头成虫连续观察5 min，若进入任意一壁内并停留1 min以上则看作其做出有效选择，若停留在主壁内则记为无反应。每5头成虫为1组，共重复10组，每组测完之后调换味源瓶和对照瓶的位置，并用95%乙醇清洁嗅觉仪，热风干燥后待用。

1.5数据分析 利用Nist17和Wiley275标准质谱图鉴别挥发物成分，峰面积归一化法测定各化学成分的相对质量分数。使用IBM SPSS Statistics 22卡方检验微红梢斑螟成虫对虫害梢果和健康梢果浸提液之间是否呈假设H0为50%∶50%的理论分布，计算卡方值和显著性水平[17]。使用Origin 2019绘制图形。

2 结果与分析

2.1微红梢斑螟诱导马尾松挥发物的变化 松梢中共获得10类化合物。其中，健康松梢中共获得53种挥发性化合物，萜类化合物16种，占比最大，其次是烃类化合物17种和酮类化合物5种；虫害松梢中共获得58种化合物，其中萜类化合物19种，其次是烃类化合物16种和醇类化合物7种；虫害松梢所获的化合物数量比健康松梢多5种。从挥发物类别的相对含量变化上看，虫害松梢相比健康松梢，萜类化合物显著上调(F=10.116，P=0.013)，醇类、酚类、酯类、酰胺类化合物显著下调(F醇=7.635，P醇=0.025；F酚=26.708，P酚=0.007；F酯=11.230，P酯=0.029；F酰胺=17.526，P酰胺=0.003)，其他化合物虽呈现下调，但是不存在显著性差异(P>0.05)(图1)。

图1 受害与健康马尾松松梢各挥发物含量比较Fig.1 Comparison of volatile content from healthy and infested shoots of P. massoniana

松果中获得9类化合物。健康松果中获得59种挥发物，其中萜类化合物19种，占比最大，其次是烃类16种和醇类6种；虫害果中获得57种挥发物，萜类化合物22种，烃类化合物16种，醇类化合物7种；虫害松果化合物数量比健康松果少2种。从挥发物类别的相对含量变化上看，虫害松果与健康松果相比，萜类化合物呈现明显的上调(F=9.371，P=0.038)，醛类和酰胺类化合物呈现明显的下调(F醛=17.785，P醛=0.014；F酰胺=9.022，P酰胺=0.017)，其他化合物不存在含量变化的显著性差异(P>0.05)(图2)。

图2 受害与健康马尾松松果各挥发物含量比较Fig.2 Comparison of volatile content from healthy and infested cones of P. massoniana

虫害梢、果的挥发物成分含量均发生变化，且都具有特异性成分。与健康梢相比，虫害梢挥发物成分含量发生变化的有11种，其中具有显著性差异变化的有6种(P<0.05)；虫害梢产生10种特异性成分，包括α-葑烯、α-松油烯、β-石竹烯、萜品油烯、壬醛、龙脑烯醛、苯甲醛、L-薄荷醇、马鞭草烯醇和4-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-酮(表1)。松果挥发物中，虫害果的特异性成分有7种，包括α-葑烯、2 -蒈烯、(+)-苜蓿烯、α-律草烯、2,6,10-三甲基十三烷、对乙基苯乙酮、2-(4-甲基苯基)丙-2-醇；其挥发物成分含量发生变化的化合物有11种，但是具有显著性变化的只有5种(P<0.05)，包括α-蒎烯、柠檬烯、β-水芹烯、萜品油烯、松香芹酮(表2)。

表1 微红梢斑螟诱导马尾松松梢挥发物成分相对含量的变化Tab.1 Changes of the relative contents of volatile components in P. massoniana shoots induced by Dioryctria rubella

续表1 Tab.1(Continued)

注：表中数据为平均值±标准差，“—”表示未检测到该化合物，同行不同小写字母表示表示受害梢和健康梢间含量差异显著(P<0.05)。
Note:Data in the table are mean ± SD,the dash (—)indicates that the compound was undetected,different lowercase letters in the same row indicate significant differences of content between infested and healthy pine shoots (P<0.05).

表2 微红梢斑螟诱导马尾松松果挥发物成分相对含量的变化Tab.2 Changes of the relative contents of volatile components in P. massoniana cone induced by D. rubella

注：表中数据为平均值±标准差，“—”表示未检测到该化合物，同行不同小写字母表示受害和健康松果间含量差异显著(P<0.05)。
Note:Data in the table are mean ± SD,the dash (—)indicates that the compound was undetected,different lowercase letters in the same row indicate significant differences of content between infested and healthy cones (P<0.05).

2.2微红梢斑螟对松梢及松果浸提液的嗅觉行为反应 微红梢斑螟嗅觉行为反应如图3所示。微红梢斑螟成虫对虫害梢浸提液的选择率可达到60%，极显著高于健康梢浸提液的(P<0.01)；其对虫害果浸提液的选择率与健康果浸提液的相近，且差异不显著。与对照正己烷对比，微红梢斑螟均显著选择松梢和松果的浸提液(P<0.05)，其中对虫害梢浸提液的选择率可达到70%，且差异极显著(P<0.001)，对虫害果浸提液的选择率达到56%，差异显著(P<0.05)。

ns，差异不显著no significant difference(P>0.05)；*，差异显著significant difference(P<0.05)；**,差异极显著extremely significant difference(P<0.01)

3 结论与讨论

通过对马尾松虫害和健康松梢及松果的挥发物定性、定量分析发现，其挥发物成分含量发生明显的变化。虫害松梢与健康松梢相比，萜类和醛类化合物含量呈现上调，腈类无明显变化，其他化合物含量均下调，并且产生了10种特异性成分。虫害松果与健康松果相比，只有萜类化合物含量呈现上调，其他类别化合物含量均呈现下调或者无明显变化，产生7种特异性成分。

微红梢斑螟成虫对虫害松梢和松果浸提液具有显著的选择趋性，且对虫害松梢的选择趋性更强。结合马尾松虫害和健康梢、果挥发物成分及含量分析，微红梢斑螟危害后的马尾松松梢和松果中挥发物成分的组成、含量的变化与其对寄主的选择具有相关性。

在已有的研究中，马尾松挥发物成分主要为萜烯类化合物[18-20]，其中含量较高的成分为α-蒎烯、β-蒎烯、柠檬烯和β-水芹烯等，这几种化合物的相对含量能达到挥发物总含量的80%以上。部分研究显示虫害诱导后马尾松挥发物中α-蒎烯的含量显著降低[18,21]，但在本研究中，微红梢斑螟危害后α-蒎烯含量却显著升高，这可能受挥发物的采集部位和害虫为害方式的影响。松果梢斑螟成虫产卵期，受害和健康球果挥发物组分变化明显，释放的挥发物成分含量差异显著[22]。虫害球果与健康球果相比，虫害球果所释放的挥发物组分和含量发生了较大的变化，且能引起强烈的EAG反应[23]。赤松梢斑螟Dioryctriasylvestrella更偏好取食受机械损伤的海岸松Pinuspinaster，表明机械损伤后产生的特异性成分芳樟醇是起引导作用的关键成分之一[24]。在本研究中，微红梢斑螟更倾向选择虫害马尾松，同其它梢斑螟类害虫存在相似性。α-蒎烯在南方松果梢斑螟的产卵位置识别中起着重要作用[12,25]；微红梢斑螟主要产卵于被害枝梢和被害球果上[2,26]，表明虫害后的松梢和松果不但对微红梢斑螟成虫具有引诱作用，也可能含有吸引成虫产卵的挥发性化合物。因此，在后续的研究中，重点在于筛选出对微红梢斑螟具有引诱作用和吸引产卵作用的挥发物成分，以期为后续引诱剂的研发奠定基础。